为加强兽药研究指导工作，规范兽药研究活动，提高兽药研究水平，根据《兽药管理条例》规定、《兽药注册办法》和《新兽药研制管理办法》要求，农业农村部兽药评审中心制定了《兽用化学药品注射剂灭菌和无菌工艺研究及验证指导原则》，已广泛征求行业专家和有关方面意见，并报经农业农村部畜牧兽医局审核同意，现予发布，请各有关单位参照执行。
附件：
兽用化学药品注射剂灭菌和无菌工艺研究及验证指导原则
一、概述
注射剂系指原料药物与适宜的辅料制成的供注入体内的无菌制剂。从严格意义上讲，无菌制剂应不含任何活的微生物，但由于目前检验手段的局限性，绝对无菌的概念不能适用于对整批产品的无菌性评价，因此目前所使用的“无菌”概念，是概率意义上的“无菌”。特定批次兽药的无菌特性只能通过该批兽药中活微生物存在的概率低至某个可接受的水平，即无菌保证水平（SterilityAssuranceLevel，SAL）来表征[1]，而这种概率意义上的无菌需通过合理设计和全面验证的灭菌/除菌工艺过程、良好的无菌保证体系以及在生产过程中严格执行兽药生产质量管理规范（GMP）[2,3]予以保证。
二、注射剂湿热灭菌工艺
（一）湿热灭菌工艺的研究
1.湿热灭菌工艺的确定依据
灭菌工艺的选择一般按照灭菌工艺选择的决策树（详见附件1）进行，湿热灭菌工艺是决策树中首先考虑的灭菌方法。湿热灭菌法系指将物品置于灭菌设备内利用饱和蒸汽、蒸汽-空气混合物、蒸汽-空气-水混合物、过热水等手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。
一般而言，需要通过各个方面的研究，使药物尽可能地可以采用湿热灭菌工艺。只有在理论和实践均证明即使采用了各种可行的技术方法之后，药物活性成分依然无法耐受湿热灭菌工艺时，才能选择无菌生产工艺。任何商业上的考虑均不能作为不采用具有最高无菌保证水平的最终灭菌工艺的理由。
1.1药物活性成分的化学结构特点与稳定性
通过对药物活性成分的化学结构进行分析，可以初步判断药物活性成分的稳定性，如果其结构中含有一些对热不稳定的化学基团，则提示该药物活性成分的热稳定性可能较差。在此基础之上，还应该通过设计一系列的强制降解试验对药物活性成分的稳定性做进一步研究确认，了解在各种条件下可能发生的降解反应，以便在处方工艺研究中采取针对性的措施，保障产品能够采用湿热灭菌工艺。对于一般降解杂质，不应仅仅因为其含量超过兽药杂质分析指导原则[1]规定的限度，就排除湿热灭菌工艺而不进行论证，如果一般降解杂质确证为代谢产物或其含量水平已经过安全性研究确认在可接受的范围内，仍推荐采用湿热灭菌工艺。
1.2处方工艺
1.3包装系统
注射剂包装系统的选择和设计也是可能影响湿热灭菌工艺条件选择和最终无菌保证水平的重要因素。研究中需要结合产品特性、包装系统的相容性、以及灭菌器的灭菌原理等，对包装系统的种类、性状、尺寸进行筛选，保证所选的灭菌工艺条件不会对包装系统的密封性和相容性产生不利的影响，如包装系统的变形、破裂，或者浸出物超过可接受的水平等。应该注意的是，使用热不稳定的包装系统不能作为选择无菌工艺的理由。
1.4注射剂的稳定性研究
无论使用何种设计方法，都需要进行最终灭菌产品的稳定性研究。考察最终灭菌工艺对产品稳定性影响的指标可包括有关物质、含量、pH值、颜色以及产品的其它关键质量属性。
1.5仿制注射剂灭菌工艺的选择
仿制注射剂选择的灭菌/除菌工艺，应能保证其无菌保证水平不低于原研制剂。如果原研制剂采用了无菌生产工艺，若仿制注射剂对其处方组成合理性、灭菌工艺产生的降解杂质等风险因素进行了全面的论证之后，也应按照灭菌工艺选择的决策树进行灭菌工艺的选择。
2.微生物污染的监控
与过度杀灭法相比，残存概率法的热能较低，为不降低产品的无菌保证水平，除了需要对灭菌过程本身进行严格的控制以外，还需要通过合理的工艺设计来降低微生物污染，并采用适当的方法对微生物污染水平和耐受性进行监测。
2.1降低灭菌前微生物污染的工艺设计
在生产工艺各环节引入微生物的风险评估基础上，通常考虑采用药液过滤、药液存放时限控制等方法来降低注射剂灭菌前的微生物污染。虽然药液过滤在最终灭菌产品的生产中仅仅作为辅助的控制手段，但是在工艺研究过程中，也应该对滤膜的孔径、材质、使用周期等基本性质进行必要的筛选和验证，并在工艺操作中进行相应的规定。药液在制备、分装过程中易引起微生物繁殖，尤其一些营养型的注射剂，因此应通过必要的考察和验证来确定药液配制至过滤前、以及过滤、灌装后至灭菌前能够放置的最长时限，并相应确定产品的批量和生产周期。
2.2灭菌前微生物污染的监测
（二）湿热灭菌工艺的验证
湿热灭菌工艺的验证一般分为物理确认和生物学确认两部分，物理确认包括热分布试验、热穿透试验等，生物学确认主要是微生物挑战试验。物理确认和生物学确认结果应一致，两者不能相互替代。
1.物理确认
1.1物理确认的前提
1.2空载热分布试验
1.3装载热分布试验
装载热分布试验的目的是在拟采用的装载方式下，考察产品装载区内实际获得的灭菌条件与设计的灭菌周期工艺参数的符合性。了解装载区内的温度分布状况，包括高温点（热点）、低温点（冷点）的位置，为后续的评估和验证提供科学依据。装载热分布一般在空载热分布的基础上进行。温度探头的个数和安装位置应综合灭菌器的几何形状、空腔尺寸、产品排列方式以及空载热分布确认的结果等要素确定，且至少应涵盖空载热分布测试获得的高温点、低温点，灭菌器自身温度测试探头部位等特殊位置。温度探头在该阶段测试中应固定，且安放在待灭菌容器的周围，注意不能接触待灭菌容器或非常接近灭菌器内壁。
装载热分布试验需要考虑最大、最小和生产过程中典型装载量情况，试验时应尽可能使用待灭菌产品。如果采用类似物，应结合产品的热力学性质等进行适当的风险评估。待灭菌产品的装载方式和灭菌工艺等各项参数的设定应与正常生产时一致，应采用适宜的方式（图表或照片）描述产品的装载方式，并评估探头放置是否合理。每一装载方式的热分布试验需要至少连续进行三次。
1.4热穿透试验
热穿透试验的温度探头的个数和安装位置可参考装载热分布设置，安装位置的确定应基于风险评估的原则，包括热分布试验确定的和其他可能的高温点和低温点、灭菌器温度探头附近、产品温度记录探头处等。除要求采用足够数量的温度探头外，还应将热穿透温度探头置于药液中最难或最迟达到灭菌温度的点、或F0值最低的点，即整个包装中最难灭菌的位置。对于小容量注射液如果有数据支持或有证据表明将探头放在产品包装之外也能够反映出产品的灭菌程度，风险能够充分得到控制，也可以考虑将探头放在容器之外。
对于F0值最大点位置的样品，由于其受热情况最为强烈，因此应评估该位置产品的稳定性情况，以进一步确认灭菌对于产品的稳定性没有影响。
1.5热分布和热穿透试验数据的分析处理
-保温阶段每个探头所测得温度的变化范围
-保温阶段不同探头之间测得的温度差值
-保温阶段探头测得的温度与设定温度之间的差值
-F0的最大值及最小值
-灭菌结束时的最低F0值
-保温阶段腔室的最低和最高温度
-热穿透温度探头之间的最大温差或F0的变化范围
-正常运行的探头数
2.生物学确认
湿热灭菌工艺的微生物挑战试验是指将一定量已知DT值的耐热芽孢（生物指示剂）在设定的湿热灭菌条件下进行灭菌，以验证设定的灭菌工艺是否确实能使产品达到预定的无菌保证水平。生物指示剂被杀灭的程度，是评价一个灭菌程序有效性的直观指标。
2.1生物指示剂选用的一般原则
生物指示剂的选用参照《中国药典》（2020年版）四部通则9207“灭菌用生物指示剂指导原则”[11]。针对具体的灭菌工艺和具体的产品，还应注意所用的生物指示剂的耐受性应强于待灭菌产品中的污染菌。
湿热灭菌工艺常用的生物指示剂有以下几种，嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillusstearothermophilus，曾用名：嗜热脂肪芽孢杆菌）、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌等。对于采用过度杀灭法的灭菌程序，生物指示剂系统主要是嗜热脂肪地芽孢杆菌的芽孢，或其他D121°C值大于1分钟的芽孢。残存概率法由于其热输入量比较低，因此在验证中使用的生物指示剂的耐受性可以小于嗜热脂肪地芽孢杆菌。
2.2生物指示剂的使用和放置
实际验证过程中可以将生物指示剂接种到待灭菌产品中或直接使用市售的生物指示剂成品。由于生物指示剂在不同介质或环境中的耐受性会有所不同，所以无论是将生物指示剂接种到待灭菌产品的方法，或直接使用市售的生物指示剂成品，均应考虑待灭菌产品对细菌芽孢耐受性的影响，如果待灭菌产品会使芽孢的耐受性增加，应采用直接接种到待灭菌产品的方法。如果生物指示剂与产品不相容，可以用与产品相似的溶液来代替产品。使用市售生物指示剂时，应确保生物指示剂的DT值和总芽孢数等主要质量参数的准确性。
生物指示剂的接种量（即初始芽孢数）需要根据生物指示剂在待灭菌样品中的耐受性和灭菌工艺条件来确定，应符合挑战性试验的要求。生物指示剂的接种量可用附件2的方法计算。生物指示剂的数量和放置位置应综合灭菌器的几何形状、空腔尺寸、产品的装载方式以及热分布确认的结果等要素确定，且在灭菌设备的冷点处必需放置生物指示剂。装有生物指示剂的容器应紧邻于装有测温探头的容器，直接接种供试品宜放置在热穿透试验产品的紧邻位置，灭菌器的其他部位应装载产品或者类似物，以尽可能的模仿实际生产时的状况。
2.3灭菌
生物指示剂挑战试验应该按照产品设定的灭菌工艺进行灭菌。每个产品的每一灭菌程序，至少需要连续进行三次生物指示剂挑战试验。
2.4检查和培养
可以根据生物指示剂的生长特性以及验证时的接种方式，采用适当的方法进行检查和培养。完成灭菌后，尽快将挑战指示剂放入培养基中进行培养。需要注意不同的生物指示剂所需要的培养条件也各不相同，建议参照所用生物指示剂的特性和供应商的说明书来选择培养条件，同时应放置阳性对照品和阴性对照品。
2.5试验结果的评价
根据生物指示剂的DT值、接种量以及挑战试验验证结果，结合产品灭菌前微生物的污染水平（耐受性及微生物污染数量）来评价产品在验证的灭菌条件下实际达到的SAL值。如果验证结果出现不合格，需要分析原因，采取相应的改进措施后重新进行验证工作。
3.基于风险评估的验证方案设计
湿热灭菌工艺验证时，如存在不同灭菌器（一般指相同工作和设计原理的灭菌器）、处方组成、容器规格、装量、装载方式等情况，在不牺牲无菌保证水平的前提下，为减少验证试验数量，降低验证成本，可综合各方面因素考虑，在风险评估的基础上，通过充分的合理性论证，选用具有代表性的灭菌器、待灭菌产品和装载方式等进行灭菌工艺验证，可不必对所有情况进行验证。
三、注射剂无菌生产工艺
注射剂应首选终端灭菌工艺。如经充分的研究（包括处方工艺研究、质量控制研究等）证实产品无法耐受终端灭菌工艺，则可考虑能否通过除菌过滤工艺进行过滤除菌，如果可以，可采用包含除菌过滤的无菌工艺；如果不可以，则可考虑采用无菌分装的全无菌工艺。
（一）无菌生产工艺的研究
1.除菌过滤工艺的研究
通常，除菌级过滤器在工艺条件下每平方厘米有效过滤面积可以截留≥107cfu（colonyformingunit，集落/菌落形成单位）的缺陷短波单胞菌（Brevundimonasdiminuta，曾用名：缺陷假单胞菌）。除菌过滤工艺通常选用0.22μm（更小孔径或相同过滤效力）的除菌级过滤器。
2.无菌分装工艺的研究
无菌分装工艺是指灭菌/除菌工艺处理后的原料药或者原料药和辅料，用无菌操作的方法分装到灭菌后的容器中再进行密封的生产工艺。无菌分装工艺的工艺研究和生产过程控制的重点同样是影响无菌保证水平的工艺步骤，主要包括物料（原料药、辅料、内包装材料等）的质量控制、物料暴露于环境中可能再污染的操作步骤等。
关于物料的质量控制，采用无菌分装工艺的制剂所涉及的所有物料，都必须采用适当的灭菌/除菌工艺处理后方可使用。各物料的灭菌/除菌工艺，都应经过验证、进行监测，并受到良好的控制。同时需要对各物料的无菌性、细菌内毒素水平等进行严格控制，通过研究确定相应的质控标准。
（二）无菌生产工艺的验证
无菌生产工艺验证主要包括除菌过滤工艺验证及无菌工艺模拟试验。采用除菌过滤工艺的产品应进行除菌过滤工艺验证及无菌工艺模拟试验，采用无菌分装工艺的产品应进行无菌工艺模拟试验。
1.除菌过滤工艺验证
1.1细菌截留试验中挑战溶液的选择
药品和/或工艺条件本身可能会影响挑战微生物的存活力，因此在进行细菌截留试验之前，需要确认挑战微生物于工艺条件下在药品中的存活情况（生存性实验/活度实验），以确定合理的细菌挑战方法。对于非杀菌性/非抑菌性的药液，直接在药液中接种测试微生物是测试除菌级过滤器（滤膜）细菌截留能力的首选方法；对于抑菌的/杀菌的药液，可采用修改工艺（如调整温度）、修改测试液配方（调整pH值、去除杀菌成分或使用产品的替代溶液）等方法对过滤器（滤膜）进行预处理后再进行细菌挑战试验。如果使用替代溶液进行试验，需要提供合理的数据和解释。对于同一族产品，即具有相同组分而不同浓度的产品，可以用挑战极限浓度的方法进行验证，替代性地接受中间的浓度。
1.2细菌截留试验条件的合理性
1.3关于除菌过滤系统的完整性测试
1.4关于滤器重复使用时的验证考虑
过滤器的重复使用对于制药过程来说是不被推荐的，如在实际工作中存在重复使用的情况，应进行充分的风险评估，包括细菌的穿透、过滤器完整性缺陷、可提取物的变化、清洗方法对产品内各组分清洗的适用性、产品存在的残留（或组分经灭菌后的衍生物）对下一批次产品质量风险的影响、过滤器过早堵塞、过滤器组件老化引起的性能改变等，并提供充分的验证和数据支持。
1.5关于采用减菌过滤工艺时应进行的验证
减菌过滤通常设计在终端灭菌工艺生产的无菌制剂的灌装前端，或非最终灭菌工艺生产的无菌制剂的除菌过滤工序前端。通常采用0.45μm或0.22μm（及以下）孔径的过滤器。针对减菌过滤应进行的验证包括化学兼容性、可提取物/浸出物及吸附试验等。
2.无菌工艺模拟试验
2.1最差条件及干预操作的代表性
应结合产品实际生产工艺，评估模拟试验设计的最差条件及干预操作是否能够涵盖实际生产过程中可能产生的情况。
2.2不同形式注射剂无菌工艺模拟试验
2.2.1注射液
注射液通常采用培养基溶液进行常规的无菌工艺模拟试验。
2.2.2注射用冻干粉末
2.2.3注射用无菌粉末
注射用无菌粉末其分装所用的生产线与常规液体灌装线不同，进行无菌工艺模拟试验时需要将培养基及模拟介质均灌装入容器中，模拟方法通常包括：使用无菌粉末分装设备将液体培养基和模拟介质进行一步灌装；加装特殊设备灌装液体培养基；先在线灌装无菌液体培养基到容器中，然后再在生产线上进行无菌粉末的分装模拟；先在生产线上进行无菌粉末的分装，然后再灌装无菌液体培养基到容器中；或其他方式。应根据具体情况设计培养基灌装工艺，并充分说明设计的合理性。
四、附件
附件1：注射剂灭菌工艺选择的决策树
附件2：生物指示剂的接种量（即初始芽孢数）的计算方法
根据公式：lgN0=F（T，z）/DT+lgNT
DT——生物指示剂在温度T/℃下的耐热参数，min；
N0——灭菌前生物指示剂的初始芽孢数；
NT——灭菌后生物指示剂的存活芽孢数；
一般在灭菌验证时，要求灭菌后所有生物指示剂为阴性结果（即全部杀灭），则NT实际能够达到10-1～10-2，甚至更低。但是，为了增加灭菌保障的安全边际，一般取NT=1，即lgNT=0。以上公式中，当生物指示剂确定后，其DT可确定，灭菌工艺确定后，所期望的灭菌值F（T，z）可确定，lgNT取0，则可计算N0。特殊情况下，若选取NT＜1计算N0，应提供合理性说明。
五、参考文献
[1]《中国兽药典》（2020年版）中国农业出版社，2020.
[3]《兽药生产质量管理规范（2020年修订）》配套文件（农业农村部公告第292号）.
[4]国家药监局药审中心.化学药品注射剂灭菌和无菌工艺研究及验证指导原则（试行）（2020年第53号）.
[5]药品生产质量管理规范（2010年修订）（卫生部令第79号）.
[6]EMA.Guidelineonthesterilizationofthemedicinalproduct,activesubstance,excipientandprimarycontainer（2019）.
[7]PDA.ValidationofMoistHeatSterilizationProcesses:CycleDesign,DevelopmentQualificationandOngoingControlTechnicalReportNo.1（2007Revision）ofPDA.
[8]PDA.ProcessSimulationTestingforAsepticallyFilledProductstechnicalReportNo.22（2011Revision）ofPDA.
[9]PDA.technicalReportNo.44Qualityriskmanagementforasepticprocesses（2008）.
[10]PDA.SterilizingFiltrationofLiquidsReportNo.26（2008Revision）ofPDA.
[11]《中国药典》（2020年版）中国医药科技出版社，2020.
[12]国家药品监督管理局.关于发布除菌过滤技术及应用指南等3个指南的通告（2018年第85号）.
[13]国家药监局药审中心.化学药品注射剂生产所用的塑料组件系统相容性研究技术指南（试行）（2020年第33号）.