水稻是我国重要的粮食作物，穗粒数是水稻产量构成的三要素之一，挖掘穗粒数关键调控基因并解析其分子机制是突破水稻单产瓶颈的有效途径。
2024年12月11日，万建民院士领衔的中国农业科学院作物功能基因组研究创新团队克隆了水稻穗粒数关键调控基因GNA，阐明了该基因通过与水稻穗型关键因子互作进而调控水稻穗粒数和产量的分子机制。
3.主要内容
3.1图位克隆
研究团队发现了一个gna突变体。gna是Oryzasativajaponica水稻品种Kitaake背景下的自发突变体，起源于组织培养过程。与野生型WT相比，gna突变体表现出半矮小紧凑的植株类型，分蘖较少，尤其是穗短，由改良的初级和次级分支组成，粒数较少。尽管由于更宽和更厚的粒度，粒重略有增加，但每株植物的最终产量仍然下降了55%（图1）。
图1gna突变体的表型特征
为了验证ORF7中缺失的片段是否是导致gna表型的原因，研究团队在WT背景中通过CRISPR/Cas9或RNA干扰（RNAi）技术制备了ORF7敲除的转基因植物。同时使用约5.8kbWT基因组片段（包括～2.9kb启动子、～1.7kb编码区和～1.2kb下游区域）回补突变体。敲除和RNAi转基因系表现出与突变体相似的植物和穗表型，并且所有阳性互补的转基因植株都重新储存了与WT的植物和穗表型（图2E和F）。所有这些结果验证了ORF7是GNA基因。
图2GNA的定位及克隆
3.2过表达GNA会增加转基因植株的粒数
当基因GNA在Kitaake的背景中过表达时，株高、穗大小和单株产量增加（图3），以及穗长、主枝和次枝数以及小穗数的增加，分蘖数和千粒重没有明显的变化。因此，得出结论，GNA主要通过增加谷物数量来提高产量。为了探索其他遗传背景下增产的潜力，采用了更多的品种，包括目前获得许可的品种宁耕3号（NG3）进行评估。过表达GNA在Nipponbare（NIP）、中华11（ZH11）和NG3的背景下，所有转基因植株在一次和次级分支的数量、每穗的粒数和每株产量方面均表现出显著增加。与各自的WTs相比，在北京和三亚的生长环境中，在NIP背景下单株产量提高了33%以上，在ZH11背景下单株产量提高了11%以上。在南京生长环境中，NG3背景的转基因植株产量提高了13%以上。上述结果表明，GNA具有提高具有不同遗传背景的品种产量的潜力。然而，产量的增加取决于背景品种的穗大小，即穗数越大，粒数的增加就越少。
图3过表达GNA的转基因植物的表型
3.3GNA与DEP1相互作用
随后，研究团队研究了GNA和DEP1之间的遗传关系。首先使用CRISPR/Cas9技术在Kitaake背景下创建了一个DEP1cri突变体，然后获得了稳定的双突变体gna/DEP1cri。与WT相比，DEP1cri的株高和穗表型略有降低（图4I、N和O）。双突变体gna/DEP1cri表现出与gna高度相似的表型（图4J-M，P-S），表明DEP1位于GNA的上游。
图4GNA与DEP1相互作用并作用于DEP1的下游
3.4GNA结合OsCKX2的启动子以抑制其表达
先前的一项研究报道了dep1突变体中OsCKX2的表达降低。基于GNA作用于DEP1下游的发现，研究团队假设OsCKX2可能是GNA的靶基因。为了验证这一假设，使用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）实验来研究GNA与OsCKX2启动子的结合能力，发现OsCKX2的启动子可以富集（图5A）。为了缩小结合位点，进行了酵母单杂交实验，发现GNA可以直接与OsCKX2的启动子结合，特别是P2/F2和P5/F6片段（图5B），这通过双LUC测定得到证实（图5C-E）。然而，只有F6内的潜在结合基序通过电泳迁移率变化测定（EMSA）实验得到验证（图5F和G）。在过表达GNA细胞系中，OsCKX2的mRNA和蛋白水平均显著降低（图5H和I）。对单突变体gna、OsCKX2cri和gna/OsCKX2cri的双突变体的遗传分析表明，突变体OsCKX2cri在穗长、初级分支数、次级分支数和粒数方面与gna/OsCKX2cri具有相似的表型（图5K和L）。以上结果表明，OsCKX2位于GNA的下游，并作为其靶基因发挥作用。
考虑到OsCKX2是一种CK降解的氧化还原酶，OsCKX2表达水平的变化应该会改变活性CKs的含量。研究团队进一步检测了过表达GNA植株花序中CK含量，发现不同的活动性CKs，如iPR、iP、iP9G、tZ和tZOG显著增加（图5J）。结果表明，GNA可以直接与OsCKX2的启动子结合以抑制其表达，过表达GNA可以通过降低OsCKX2的表达来积累活性CKs的含量，从而增加GNP。
图5OsCKX2是GNA的直接下游靶基因
3.5DEP1增强GNA对OsCKX2的抑制作用
为了研究DEP1如何通过GNA影响OsCKX2的表达，检测了水稻原生质体中OsCKX2启动子和LUC基因的融合报告基因的表达水平。结果表明，GNA可以抑制OsCKX2的表达水平，当GNA与DEP1或depl共存时，其对OsCKX2的抑制作用比单独存在GNA时更强（图6A-C）。DEP1和dep1对GNA对OsCKX2表达的抑制表现出相似的增强能力（图6D）。检测到OsCKX2在gna、WT、DEP1cri和gna/DEP1cri双突变体中的表达水平，在gna和DEP1cri中发现表达水平略有增加，在双突变体gna/DEP1cri中发现显著增加（图6E），研究团队进一步发现，NIL-dep1中出现的GNA比NIL-DEP1中更高，而OsCKX2表达水平更低（图6F、G）。
为了探索该模块在育种中的潜在应用，研究团队对777个栽培品种的GNP进行了单倍型分析和关联测试。GNA的三种精英单倍型，DEP1的1个精英单倍型和OsCKX2的3种精英单倍体型表现出更高的GNP。随后进行了组合单倍型（CH）分析。结果表明，与所有3个基因的精英单倍型相结合的品种在GNP增加方面显示出最高的潜力（CH1，图6H和I），此外，CH1单倍型在地方品种（LAN）或改良品种（IMP;图6J），表明CH1作为精英单倍型在育种应用中仍然可用。
图6DEP1增强OsCKX2上GNA的转录抑制以及水稻种质中存在多种单倍体类型的GNA、DEP1和OsCKX2
3.6GNA有利于DEP1细胞核定位
在本氏烟草叶片表皮细胞中通过体内生物分子荧光互补（BiFC）测定验证GNA和DEP1之间的相互作用，研究团队发现BiFC荧光在GNA+DEP1和GNA+dep1的组合之间显示出不同的亚细胞位置。在前者中，只有一小部分转染细胞显示核定位信号，这与后者中稳定的核定位形成鲜明对比。与单独表达DEP1相比，当DEP1与GNA共表达时，DEP1的核定位更加明显。结果还显示，只有DEP1而不是dep1受到影响，即使没有GNA，dep1也显示出稳定的核定位信号。
研究团队利用由gna、WT和GNAOE幼苗制备的水稻原生质体来检测DEP1-GFP/dep1-GFP表达。发现DEP1仅在gna中表现出膜定位。在WT中，DEP1表现出各种定位模式，包括细胞膜、细胞质和细胞核定位，表明DEP1蛋白倾向于从膜导入细胞核。在GNAOE原生质体中，DEP1在细胞核中可见更高比例。然而，无论是在gna还是GNAOE背景下，dep1蛋白在细胞核和膜中始终表现出稳定的共定位。研究团队分别计算了来自gna、WT和GNAOE植物的原生质体中核定位的百分比。当DEP1表达时，只有1.2%的gna细胞核、23.5%的WT细胞核和71.4%的GNAOE细胞核具有DEP1。相比之下，无论原生质体背景如何，当dep1表达时，所有检测到的细胞核都包含dep1（图7、A和B），表明GNA对于DEP1的核定位是必需的，而不是dep1。
图7GNA有利于DEP1的核转位
4.研究意义
该研究阐明了水稻穗粒数关键调控基因GNA调控穗粒数增加的分子机制，为水稻遗传改良及分子设计育种提供了重要基因资源和理论基础。