在过去的几个世纪，发酵工程经历了以生产食品等生活资料为主的自然发酵过程，转变为以生产生活资料和工业基础资料并重的代谢控制发酵过程。在此过程中，发酵工程经历了天然发酵阶段、纯种发酵阶段、深层发酵阶段等，在菌种选育、过程控制、分离技术等方面有了长足发展。近30年来，生物技术的迅速发展，为新时代发酵工程的发展提供了重要的基础，使得科学家和工程技术人员可以利用发酵工程实现更多的目标，实现对其他行业的支撑作用，如医药行业、食品工业、农业和畜牧业、能源与材料、纺织、造纸与皮革工业、日化行业、环境生态等。进入21世纪，人类的可持续发展与生态环境、资源能源等矛盾日益突出，如何发挥发酵工程的关键作用，也是发酵工程研究人员的一个主要任务。系统生物学、合成生物学、生物信息技术、先进材料科学的发展，也给发酵工程带来了很多革命性的提升。采用先进的生物技术，可以实现好氧发酵转厌氧发酵、发酵食品微生物群落的人工合成、构建自养型微生物发酵工厂、人工合成酶等一系列前所未有的转变，发酵工程可以更好完成未来更为艰巨的挑战。
一般认为，发酵工程的发展，包括以下几个阶段，即：天然发酵阶段（公元前至公元1680年）、纯培养发酵阶段（1680年至1928年，以显微镜的发现作为分界）、深层发酵技术阶段（1928年后，青霉素的发现和大规模工业发酵）、现代发酵工程技术阶段（1980年后，基因工程的出现和工业应用），新一代发酵工程技术（2000年后，合成生物学和信息技术的整合与应用）。发展历程见图1。
1.1天然发酵阶段
大量的考古研究发现，在有文字记录以前，人类就开始利用天然微生物生产多种发酵产品，如各种乙醇饮料、发酵面包制品等[11-12]。在人类历史的大部分时期，人类并不知道微生物的存在和发酵的原理，一般直接采用自然界的微生物，完全依靠经验进行生产。在这种情况下，通常存在发酵失败率高、产品质量参差不齐等问题。由于无菌操作认识的限制，这一时期多为厌氧发酵。厌氧发酵可以产生乙醇、乳酸等物质，抑制部分有害微生物，从而提高发酵成功率。随着经验的积累，人们开始有意识地选择和保存优良的发酵菌曲，并对发酵过程进行控制，建立了加热、密封等原始的消毒和灭菌操作。在这一阶段后期，发酵产品的种类开始丰富起来，如黄酒、啤酒、葡萄酒、面包、酸奶、醋、酸菜、腐乳等，改善了人类的生活水平和营养状况。
1.2纯种发酵阶段
虽然经历了长期的积累，但是发酵过程的稳定性和可控性一直是一个难题。显微镜的发明使得人们可以直接观察到微生物。在此基础上，科学家们揭开了发酵过程的原理。在对微生物的研究过程中，建立了菌种分离纯化技术和无菌操作技术。人类从依赖经验的天然发酵阶段，进入到纯种发酵阶段。基于纯种发酵培养，发酵过程的稳定性和可控性得到了极大的增强。发酵产品的种类和数量也得到进一步提升，除了发酵食品外，丙酮、丁醇[13]、乙醇[14]等工业产品的发酵也逐步建立起来，使得发酵工程逐步从以生产食品等生活资料为主的自然发酵过程，转变为以生产生活资料和工业基础资料并重的代谢控制发酵过程。在这一阶段时期，积累了大量的关于发酵微生物的生长代谢性质，如最佳接种量、最佳接种时期、最佳pH、最佳温度、最佳培养基、副产物积累以及菌体生长和产物积累的相互作用等。通过收集和分析数据，进一步用于指导优化发酵过程。在此阶段开发和应用了一系列的监测和反馈元件，显著提升了发酵效率。
1.3深层发酵阶段
20世纪80年代后，基因工程技术的出现推进了其他学科的迅速发展，国际和国内发酵工程进入到现代发酵工程阶段。发酵工程根据生产流程，被划分为上游、中游和下游工程3部分。上游工程主要为菌种的选育和改造，以期获得生产性能良好的菌株。中游工程主要为发酵过程控制，通过对发酵过程中各种参数的采集、分析和反馈，获得产品积累的最佳发酵条件。下游工程主要是对产品的分离和纯化，采用多种技术将发酵产品从发酵液或者细胞中分离、纯化出来，达到指标后制成产品，最终进入消费市场（图2）。
2.1菌种选育
20世纪70年代以后，随着基因工程技术和其他支撑学科的融合发展，在基因水平对发酵菌株进行改造成为可能。基于基因工程，可以导入外源基因，生产菌种原来并不生产的物质，如胰岛素等[18]。基于基因工程也可以对菌体本身的基因或者途径进行强化或弱化，改变菌体的物质流和能量流，向着提高产品的通路流动，如对谷氨酸棒状杆菌进行改造，可以获得积累L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸的菌株[19]。基于基因工程甚至可以改变菌体的生理性状，使得菌株的耐受性获得改善，产品利于分离，降低中游和下游的操作难度和成本，如α-酮戊二酸耐酸菌种的构建，可以有效提高α-酮戊二酸的积累，降低了中游发酵难度和下游分离成本[20]。现代菌种构建技术结合飞速发展的高通量测序技术、生物信息学技术、高分辨率质谱和核磁技术、同位素标记技术、高分辨率电镜技术等，可以方便快捷对菌种的各项性能进行快速鉴定，进而指导对菌株的理性改造，获得性能更加优异的菌种。
2.2过程控制
发酵反应的重要场所是发酵罐，发酵过程控制主要基于发酵罐进行。发酵罐一般具有管路系统（空气、物料输入输出、温控管路等）、搅拌系统（搅拌桨、搅拌轴和电机等）、检测系统（温度、pH、溶解氧、甲醇体积分数等）、数据分析系统和反馈系统（蠕动泵，加热模块、电机等）等。图3为一个典型的发酵系统示意图。
发酵过程控制系统包括数据采集系统、数据分析系统和反馈操作系统。数据的采集包括温度、pH，溶氧、OD值、转速、压强以及铵离子、金属盐离子、甲醇、葡萄糖、乳酸、谷氨酸、乙醇等含量。加装尾气检测装置后，可以分析尾气中水分、氧气、二氧化碳等浓度。数据分析系统根据获得的数据可以直接用于反馈操作系统，也可以对初级数据进行加工获得次级数据，如比生长速率等，然后再用于反馈操作系统。反馈操作系统根据获得的数据，对发酵条件进行在线调整，如调节温度、转速、流加速度和通气流量等，以维持发酵条件处在最佳状态，提高产物的积累量。多年来，发酵过程控制也逐渐由简单控制向智能控制转变，发展出了诸如模糊控制等复杂的发酵控制策略[21]。
2.3分离技术
对发酵液中产品的分离纯化，占到整个发酵成本的20%以上，并且直接影响产品的质量。将产品从发酵液或者细胞中分离出来，一般包括破碎、离心、过滤、萃取、色谱分离、膜分离、浓缩、结晶、干燥、制剂等步骤。根据不同的产品，会选用不同的分离流程。随着材料科学的不断发展，产品分离越来越依赖于高性能材料，如使用不同的高分子材料制成的半透膜以及色谱填料等。
2.4发酵工程对其他行业的支撑作用
现代发酵工程技术已经和众多行业深度交叉整合，产生了巨大的社会和经济效益。
2.4.1医药行业
医药行业是发酵工程技术应用最为广泛的领域。据统计，60%以上的生物技术运用于医药卫生方面。正是由于对抗生素的巨大需求，直接推动了有氧发酵技术的快速发展和完善，发酵工程进入到深层发酵阶段。基因工程的兴起，使得发酵工程可以用于生产更多抗生素、药品、补充剂等。基因工程的深度介入，发酵工程也被用于生产生物活性物质，如胰岛素、疫苗、单克隆抗体、激素等[22-23]。
2.4.2食品工业
基于发酵工程选育高品质菌株，结合发酵控制技术，可以获得品质提升显著的发酵食品，同时降低生产成本[24]。天冬酞胺酶可以降解丙烯酰胺，用于油炸类食品，可以提高油炸食品的安全性[25]。通过定向进化和分子机制解析，调控黄酒酵母的氮代谢阻遏，可以有效降低有害物质氨基甲酸乙酯在黄酒中的积累[26]。发酵生产蛋白酶和半乳糖酶，可以减少乳制品中的过敏原[27]。发酵工程也为食品行业提供了大量的食品添加剂，如维生素C、柠檬酸[28]、天然色素[29]等。
2.4.3农业和畜牧业
农业为发酵工业提供了大部分原料，如淀粉、糖蜜、豆粕、纤维素等，这些都直接来自农副产品。同时，发酵工业产品也大量应用于农业和畜牧业。抗生素，如金霉素、土霉素等[30]；饲料添加酶制剂，如果胶酶[31]、木聚糖酶[32]、植酸酶等；生长激素，如赤霉素[33]、脱落酸[34]等；营养补充剂，如维生素C[35]、维生素B2、各种氨基酸等；生物防治害虫技术，如苏云金芽抱杆菌可用于杀灭害虫[36]、阿维菌素可用于治疗线虫类疾病等[37]。
2.4.4能源与材料
随着化石能源的枯竭和对环境的污染，生物能源逐渐进入人们的视野。利用玉米、甘蔗、木薯等淀粉发酵生产的生物乙醇，可以有效解决生产过剩和库存过剩。目前，多家公司开发了纤维素酶或者产纤维素酶菌株用于发酵，可以利用木质纤维素生产新一代生物乙醇，进一步扩大了生物能源的范围[38]。除了利用废弃木料外，开发藻类等自养型微生物进行固碳[39]，生产微藻能源，也是生物能源的重点领域。利用发酵工程也为各种新材料提供了原料，如发酵法生产3-羟基丙酸用于合成高聚物等[40]。
2.4.5纺织、造纸与皮革工业
在传统产业中，纺织、造纸与皮革产业历来都是高能耗与高排放的行业，需进行技术升级以实现节能减排。通过发酵法生产角质酶、果胶酶、聚乙烯醇酶和过氧化氢酶代替传统的热碱工艺除去天然纤维的蜡质层，可实现能耗减少43%、水耗减少32%、成本减少41%[41]。使用发酵生产的脂肪酶、角蛋白酶甚至可以完全替代皮革工业中化学品的应用[42]纺织等工业产生的废水也可以使用过氧化氢酶、漆酶进行处理[43]。
2.4.6日化行业
早期只有一些简单的发酵产品用于日化行业，如在洗衣粉中添加蛋白酶和脂肪酶。随后一些可以用于人体护理的发酵产品开始用于日化产品的添加，如用于保湿的透明质酸[44]、小核菌胶[45]。一些具有美白和香氛作用的小分子也陆续使用发酵法替代了原始的植物提取，如熊果苷[46]、人参皂苷[47]、苯乙醇[48]等。还有添加了益生菌的牙膏[49]，有助于维护口腔健康。
2.4.7环境生态
近年来，随着人类生活水平的提高，人们对生态环境的重视与日俱增。发酵工程技术已经广泛应用于环境生态的改良和改善中，取得了良好的效果。除了开发生物质能源降低使用化石燃料对环境的碳排放、使用酶制剂降解纺织业的工业废水外，发酵工业在土壤重金属富集[49]、塑料制品降解[50]、生物基可降解塑料[40]等方面也应用广泛。
3.1发酵工程技术与新能源
自从工业革命以来，人类对不可再生化石燃料的大量开发与使用，导致全球污染、气候异常越来越常见，严重威胁了人类的生存。同时，化石燃料资源储备减少，开采难度增加，开采成本提高。因此，环境友好型的新能源越来越成为重点研究领域。
3.2发酵工程支撑技术的发展
3.3发酵工程技术趋势
3.3.1通过平衡还原力使好氧发酵转厌氧发酵
目前好氧发酵占据主流发酵地位，但是好氧发酵中相当多的能量进入TCA循环消耗掉，同时也有相当一部分物质用于细胞合成，这部分能量和物质都未进入产品生产，降低了物质利用效率和产品转化率。厌氧发酵中，TCA循环基本没有活性，经由TCA循环消耗的能量较少；厌氧发酵中，细胞量较少，进入细胞合成的物质流较少，因而底物利用率和产品转化率较高。但是微生物经由厌氧发酵时由于不经过TCA循环，细胞几乎不利用氧气，容易造成还原力无法循环而失衡，阻碍菌体生长。通过引入新的途径，可以重新打通还原力循环，恢复还原力平衡（图4）。
3.3.2发酵食品微生物群落的人工合成
发酵食品的人工合成菌群系统具有相对简单、可重复、可培养等特点。实现人工合成（组装与调控），可解决风味、安全与健康等问题。首先需要对发酵食品中原来菌群组成进行鉴定。通过宏基因组测序、扩增子测序及荧光定量PCR等技术，确定原始菌群中微生物数量、种类及随发酵进程的丰度变化。在确定原生菌群组成后，进一步对菌群功能进行分析。对发酵系统的发酵条件如pH、温度、盐分、水分等进行控制，或对发酵体系中的菌群进行不同组合的接种，利用合成生物学、代谢组学等技术对发酵体系进行检测，确定各种微生物之间相互作用、微生物与环境之间的相互作用，确定不同微生物对发酵产品品质的影响。最后，对发酵体系中原有的微生物进行改造、替换或者删减，获得人工合成的微生物群落并用于发酵，获得品质提升的发酵产品（图5）。
Wang等通过对中国淡香型白酒发酵过程中的微生物群落进行分析，确定了乳酸菌、酿酒酵母菌、毕赤酵母、假丝酵母及毕赤酵母等5种为核心菌群。构建了基于核心菌群的人工菌群并进行发酵，实现了清香型白酒的稳产和可重复操作[61]。May等仔细分析了康普茶中微生物种类及在发酵康普茶中各种微生物的作用。发现酵母菌的主要作用为糖化底物和合成乙醇，细菌的主要作用为产生生物膜及合成有机酸。其中生物膜起到物理隔离杂菌入侵的作用，而乙醇和有机酸则可以对入侵的杂菌起到抑制生长的作用[62]。
3.3.3构建自养型微生物发酵工厂
微生物大体上可以分为以二氧化碳为碳源的自养型微生物和以有机物为碳源的异养型微生物。以异养型微生物为菌株进行发酵，碳源占到发酵成本的30%~70%，如果菌体可以实现碳源自养，将可以节省成本1/3以上。尽管人们对微生物自养型生产产品兴趣浓厚，但迄今为止，改造异养微生物实现固定二氧化碳，仍然是一个严峻的挑战（图6）。
3.3.4人工设计酶
从自然界获得的酶催化效率较低时，大部分只能在实验室通过费时费力的适应性进化来筛选催化效率提高的突变体。蛋白酶的结构决定了自身的功能，根据酶的结构和功能之间的关系，理性设计和改造活性位点，设计高催化活性的酶，甚至创造具有新功能的酶，就可以大大降低筛选酶的工作量，提高成功率（图7）。
Li等基于人工智能蛋白质设计技术，综合选用势能计算、近似反应态几何尺度限定与蒙特卡洛随机序列空间扫描等计算方法，构建了具有绝对位置选择性与立体选择性的人工β-氨基酸合成酶。人工设计的酶转化率高达99%[65]。乙酞辅酶A是重要的中心化合物，是多种重要化合物合成的起点化合物，但是在大肠杆菌中，从葡萄糖合成乙酞辅酶A路径长且耗能高。Lu等基于硫胺素焦磷酸TPP介导的碳碳成键催化机理，首先设计了一个全新的羟基乙醛合酶，然后基于磷酸转酮酶的催化原理，设计了一个全新的乙酞磷酸合酶。将两个人工合成的酶同时导入到菌体中，创建出仅三步合成乙酞辅酶A的非天然全新途径，可以以甲醇、甲醛或乙醇醛为碳源维持细胞生长[66]。基于人工设计，获得自然界不存在的酶，建立特殊的反应，是未来发酵工程的重要发展方向。
现代生物技术具有可预测、可再造、可调控等特点，在人造生命、器官再造、生物存储、高能细胞、人机交互等方面发展迅速。新一代发酵工程技术的关键是智能、节约和高效。中国发酵工业技术与国际最先进水平的关系大多数还是跟跑和伴跑，开展新一代发酵技术是实现领跑的契机。通过与其他学科的交叉融合，发酵工程技术的主要研究应该从产品制造和技术改进，拓展到新理论的发现、新方法的发明、新学科的发生、新产业的发展，对中国传统产业升级、新经济形态构建、经济和国防安全保障做出重要贡献。
陈坚
中国工程院院士，江南大学生物工程学院教授、博士生导师。现任江南大学未来食品科学中心主任，国家现代农业与食品前沿产业技术创新战略联盟专家指导委员会委员，兼任国务院学位委员会轻工技术与工程学科评议组召集人、教育部科技委农林学部副主任、粮食发酵工艺与技术国家工程实验室主任、FoodBioscience主编、国际食品科学院（IAFoST）Fellow、国际生物加工学会（IBA）Fellow。