本发明涉及生物技术领域，具体提供了一种芦花羽绿壳蛋鸡的培育方法。
背景技术：
外包装性状和鸡蛋品质是优质蛋鸡育种的方向。培育体型优美、蛋品质优良的优质蛋鸡新品系可满足市场对高端鸡蛋产品的需求。近年来，具有绿壳标志的鸡蛋因外观漂亮、营养全面而深受消费者喜爱，市场份额逐年增加。具有横斑羽毛的汶上芦花鸡是我国优良地方鸡种，体型优美，蛋品质优良，在国内享有极高声誉。
芦花基因b是位于z性染色体上的显性遗传基因，目前没有有效的基因检测方法，但可利用伴性遗传的原理加快选育进程。绿壳基因(o)是位于常染色体上的显性基因，研究发现，母鸡1号染色体的slco1b3基因启动子区域存在eav-hp的插入，使得slco1b3基因在母鸡的卵壳腺中特异表达，因而导致母鸡产绿壳蛋，而不产绿壳蛋的母鸡的slco1b3基因由于不含eav-hp插入而不表达；绿壳基因的发现为蛋鸡育种提供了快捷的检测手段。
目前，国内外尚无同时具备芦花羽和绿壳蛋特征的鸡种，将芦花羽和绿壳蛋组合在一起培育而成的新品系，将会具有广阔的市场前景。但是现有技术中缺乏相应的技术方案，如何弥补这一问题带来的缺憾成为亟待解决的技术难题。
技术实现要素：
本发明的发明人针对现有技术存在的空白之处，提供了一种芦花羽绿壳蛋鸡的培育方法，该方法通过选择最佳的亲本品系，采用现代常规育种技术和分子检测技术相结合的选育技术，将芦花羽、绿壳蛋、高产蛋数、优良蛋品质等基因进行聚合，快速培育具有芦花羽和绿壳蛋特征、产蛋性能好、蛋品质优良的新品系是本发明的核心内容。本发明培育的新品系特征明显、性能优良，外观特征：单冠、芦花羽、绿壳蛋，体型优美；主要性能水平：开产日龄155天，母鸡平均开产体重1.35kg，72周龄入舍母鸡产蛋数210枚，平均蛋重48g，蛋品质优良；在保持蛋品质优良的前提下，年产蛋量比一般地方鸡提高20％以上。
本发明的具体技术方案是：
(1)用具有不同血缘的汶上芦花鸡公鸡与新杨绿壳蛋鸡母鸡杂交，产生f1代；
(2)f1代为芦花羽且经绿壳基因检测证明携带绿壳基因的公母鸡横交产生f2代；
(3)从f2代中挑选芦花羽、并经与非芦花羽母鸡测交证明为芦花羽纯合子的公鸡和具有芦花羽的母鸡，进行绿壳基因检测，选留芦花羽和绿壳基因均为纯合子的公母鸡横交，产生f3代；
(4)在f3代中选留芦花羽公母鸡，并进一步通过绿壳基因检测剔除杂合子，动物模型blup方法估计候选公母鸡产蛋量的育种值，选择育种值高的个体留种，留种公母鸡采用避开同胞交配的随机交配方式产生f4代；
更为具体步骤如下：
(1)从具有芦花羽、优质蛋特性的汶上芦花鸡种群中选择种公鸡，从具有产绿壳蛋、产蛋多优势的新杨绿壳蛋鸡配套系中选择商品代母鸡，公母鸡杂交产生f1代；
其中步骤(2)中所述绿壳基因检测方法为：每只鸡抽血样提取dna，
设计p1：5'-tttgaccagcgtagataa-3',其核苷酸序列如seqidno.1所示；p2:5'-taggttccgoocgcgatgt-3',其核苷酸序列如seqidno.2所示；p3:5'-atgttagcagtgtagttg-3'，其核苷酸序列如seqidno.3所示；三条引物对提取的dna进行pcr扩增，
pcr反应体系：模板dna1μl，引物p1、p2、p3各0.5μl，pcrmix10μl，双氧水7.5μl，合计20μl；
pcr扩增条件:95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃最后退火5min，pcr扩增产物用琼脂糖凝胶电泳法鉴定；
根据电泳结果判定每个样品的基因型：
只有一条425bp条带的为绿壳基因纯合子(oo基因型)，只有一条340bp条带的为非绿壳基因纯合子(oo基因型)，同时有两条带的为绿壳基因杂合子(oo基因型)。
(3)从f2代中挑选芦花羽、并经与非芦花羽母鸡测交证明为芦花羽纯合子的公鸡和具有芦花羽的母鸡，进行绿壳基因检测(检测方法同步骤(2))，选留芦花羽和绿壳基因均为纯合子的公母鸡横交，产生f3代；
其中所述芦花羽纯合子的公鸡的测交方法为：每只公鸡与1只非芦花羽母鸡交配，每只母鸡收集种蛋15枚，按系谱孵化，每只公鸡将会有10只以上后代，只要有一只后代为非芦花羽，则可判定该公鸡为芦花羽基因杂合型，否则为芦花羽基因纯合子。
(4)在f3代中选留芦花羽公母鸡，并进一步通过绿壳基因检测(检测方法同步骤(2))剔除可能的杂合子。母鸡单鸡单笼饲养，记录每日产蛋情况，测定至40周龄结束。结合系谱资料，采用动物模型blup方法估计所有公母鸡产蛋量的育种值。育种值估计时采用的模型如下：yij＝μ+hi+aj+eij，其中，yij为个体至40周龄产蛋数，hi为世代固定效应，aj为个体育种值，eij为随机残差效应。
利用动物模型不仅能估计母鸡产蛋数的育种值，也可以把公鸡的产蛋数育种值估计出来。按照育种值大小对公母鸡分别排序，选择育种值高的公鸡60只，母鸡600只留种，采用避开同胞的随机交配产生f4代，每只母鸡的后代数10只左右。
至f6代，育种群的羽色、蛋壳颜色和产蛋数达到既定育种目标、遗传稳定。
其中步骤(1)中所述汶上芦花鸡来自汶上芦花鸡原种群，具有纯合芦花羽基因型，72周龄产蛋量180枚，平均蛋重45g，蛋壳颜色粉色，蛋品质优良；所述新杨绿壳蛋鸡母鸡来自新杨绿壳蛋鸡商品代，该鸡种72周龄产蛋量230枚，平均蛋重50g，蛋壳颜色浅绿色。
本发明具有以下优点及有益效果：
本发明通过亲本品系的优化选择、现代常规育种技术和分子检测技术相结合的选育技术，快速培育具有芦花羽、绿壳蛋、蛋品质优良特征的蛋鸡新品系，新品系特征明显、性能优良，育种效益高。该品系的外观特征：单冠、芦花羽、绿壳蛋，体型优美；性能特点：开产日龄155天，母鸡平均开产体重1.35kg，72周龄入舍母鸡产蛋数210枚，43周龄平均蛋重48g，蛋黄为金黄色，罗氏比色度≥10，质量比31.3％；蛋清光亮胶着，质量比58.2％；蛋壳强度：4.12kg/cm2。
附图说明
图1为本发明所述绿壳基因检测结果示意图；
图中oo为绿壳基因纯合子，oo为绿壳基因杂合子，oo为非绿壳基因纯合子。
具体实施方式
下述实施例中除特殊注明外，其他均采用现有常规技术，
实施例
一种芦花羽绿壳蛋鸡的培育方法，包括以下步骤：
(1)确定育种目标：育成的新品系具有芦花羽外貌特征，72周龄产蛋数200枚以上，蛋壳颜色绿色，平均蛋重45-50g，蛋品质优良。
(2)育种素材的选择：公鸡来自汶上芦花鸡，该品种具有芦花羽外貌特征，72周龄产蛋量180枚，平均蛋重45g，蛋壳颜色粉色，蛋品质优良。母鸡来自新杨绿壳蛋鸡(配套系)商品代母鸡，该鸡种72周龄产蛋量230枚，平均蛋重50g，蛋壳颜色浅绿色。通过以上两个鸡种杂交，将芦花羽和绿壳基因整合到一个新品系中，使新品系的产蛋量提高并保持优良的蛋品质。
(3)杂交方法：选用240日龄不同血缘的汶上芦花鸡公鸡100只和42周龄产蛋量高的新杨绿壳蛋鸡商品代母鸡600只，按公母鸡1:6的比例随机配种，每只母鸡收集种蛋16枚，按家系进行系谱孵化，产生6000余只f1代。
(4)f1代的选择：芦花羽基因(b)为伴性遗传基因，因此可知f1代公鸡为芦花羽杂合子(zbzb)，母鸡为芦花羽纯合子(zbw)。但由于新杨绿壳蛋鸡为绿壳基因杂合型，同时携带显性白和黑羽基因，f1代中为芦花羽鸡约占一半。在芦花羽鸡中携带绿壳基因的大约有1/2。10周龄时从f1代中挑选来自不同家系的芦花羽公鸡200只、母鸡1000只，抽血样提取dna，检测绿壳基因，具体方法如下：
pcr扩增条件:95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃最后退火5min，pcr扩增产物用琼脂糖凝胶电泳法鉴定；根据电泳结果判定每个样品的基因型：
经基因检测证明携带绿壳基因的公母鸡(oo基因型)饲养至30周龄，并根据母鸡是否产绿壳蛋进一步确认母鸡的基因型，此时挑选了携带绿壳基因的公鸡80只、母鸡400只，按公母1:5比例选配产生f2代，每只母鸡有10-12个后代。
(5)f2代种鸡的选择：10周龄时从f2代中挑选来自不同家系的芦花羽公鸡600只、母鸡1200只(公母鸡大约有1/4的绿壳基因纯合子(oo基因型))，抽血检测绿壳基因，经过基因检测证明为绿壳基因纯合子的公母鸡饲养至30周龄，此时选留公鸡150只，母鸡300只。150只公鸡中大约一半为芦花基因杂合子，需要用测交的方法淘汰这些个体。具体测交方法如下：
每只公鸡与1只非芦花羽母鸡交配，每只母鸡收集合格种蛋15枚左右，按系谱孵化，每只公鸡将会有10只以上后代，只要有一只后代为非芦花羽，则可判定该公鸡为芦花羽基因杂合型，否则为芦花羽基因纯合子。
选择经测交证明为芦花基因纯合子的公鸡60只，与留种的300只芦花羽绿壳蛋纯合子母鸡按公母1:5比例横交产生f3代，每只母鸡10个以上后代。
(6)f3代种鸡的选择：在f3代中选留芦花羽公母鸡，并进一步通过绿壳蛋基因检测剔除可能的杂合子。母鸡单鸡单笼饲养，记录每日产蛋情况，测定至40周龄结束。采用动物模型blup方法估计所有公母鸡产蛋量的育种值。育种值估计时采用的模型如下：
yij＝μ+hi+aj+eij，其中，
yij为个体至40周龄产蛋数，hi为世代固定效应，aj为个体育种值，eij为随机残差效应。
(7)f4-f6代，重点选择产蛋数，每代性能测定产蛋母鸡数2400只以上。每个世代的育种群规模、性能测定方法、选择方法、选配方式同(4)中f3代。
该发明育成的新品系的体型外貌特征及主要的性能指标如下：
体型外貌特征：公鸡：体型较大，身体大部分羽毛呈黑白相间的横斑羽，部分成年鸡颈羽和鞍羽呈红色或黄色，尾羽高翘。母鸡：全身羽毛为黑白相间的横斑羽型，颜色比公鸡略深，羽毛紧密，清秀美观。公母鸡均为单冠；喙为黄白色；跖多数为白色，少数为浅黄色；皮肤为白色。
产蛋性能与蛋品质：开产日龄与体重：50％产蛋率日龄155天左右，平均开产体重1350g左右；产蛋量：入舍鸡72周龄产蛋210枚；蛋重：43周龄平均蛋重48g；蛋壳：绿色，厚度0.31mm；质量比10.5％；蛋黄：金黄色，罗氏比色度≥10，质量比31.3％；蛋清：光亮胶着，质量比58.2％；蛋形指数：1.31；蛋壳强度：4.12kg/cm2；哈氏单位：75.4。
繁殖性能：种蛋受精率96.3％，受精蛋孵化率94.5％。
与亲本品种比较，开产日龄比父本品种汶上芦花鸡提前10天，72周龄产蛋量提高了20％，尽管产蛋量低于母本品种新杨绿壳蛋鸡，但本发明品种的蛋壳强度、蛋黄颜色与质量比等指标与父本品种相当，但均优于母本品种，满足了消费者对优质鸡蛋的要求，生产效率高于大多数地方鸡种。