微藻富含脂类、蛋白质、碳水化合物和其他高值化合物,包括虾青素、类胡萝卜素、叶黄素、茉莉酸、多不饱和脂肪酸等。与传统作物相比，微藻具有生长速度快、光合效率高、固碳能力强的特点,每培养生产1t微藻最高可以捕获1.83tCO2。微藻可在海水、盐碱地、滩涂和荒漠中生长,而且还可以利用废气钟CO2和废水中氮、磷等营养物质,在生产高值产品的同时去除污染物。因此,微藻被认为是一种可以用于食品、饲料、化学品和能源的可持续生产的重要原料。
相较于微藻的单独培养，两阶段培养需要更多的系统单元和操作步骤，工艺流程相对复杂,待优化的技术环节增多。现有研究已经报道了多种微藻两阶段培养技术，综合分析现有的微藻两阶段培养技术有助于识别生产工艺中存在的技术瓶颈,明确两阶段培养技术的商业化应用潜能。本文总结近年来微藻两阶段培养技术的应用现状，解析目前微藻两阶段技术应用的限制因素及发展前景,为今后微藻两阶段培养规模化生产方案的科学决策与实施提供参考。
利用微藻两阶段培养技术生产生物能源
“双碳”目标推动构建清洁低碳安全高效的能源体系。国家发改委和国家能源局发布的《能源生产和消费革命战略(2016-2030)》中明确提出到2030年使我国非化石能源的消费比重达到20%,同时单位国内生产总值CO2排放比2005年下降60%-65%。
1.1油脂
微藻油脂含量高,其油脂中富含三酰甘油,三酰甘油是制备生物柴油的理想原料。微藻的固碳和产脂能力是传统油料作物的数十倍。当前,通过培养微藻生产生物柴油的技术路线已经打通,但生产成本较高。2022年,我国微藻生物柴油的生产成本约合1.99美元/kg,远高于石化柴油的市售价格(约085美元/kg)。生物量和油脂含量是影响微藻油脂产率的两大因素，二者一般存在“此消彼长”的关系,导致在微藻培养过程中难以获得较高的油脂产率，制约了微藻生物柴油的商业化发展。两阶段培养技术能够兼顾微藻的生长和油脂积累,成为近年来产油微藻培养工艺中的研究热点。如图1所示，目前微藻的两阶段培养产脂技术主要通过耦合胁迫、耦合废水处理,或是通过代谢转换,以及利用强化生长或油脂合成的诱导剂,在获得较高生物量的同时获得较高的油脂含量。下面对这几.种微藻两阶段培养产脂技术进行介绍。
1.1.1耦合胁迫手段的两阶段培养产脂技术
结合微藻生物量和油脂含量这种“此消彼长"的特性,研究人员开发了两阶段培养技术,首先在第I阶段通过适宜的培养条件获得大量微藻生物量,在第I阶段耦合胁迫,提高这些微藻的油脂含量,从而兼得较高的生物量和油脂含量,获得较高的油脂产率。通过在第I阶段应用不同的胁迫方法,可以构建多种类型的两阶段培养技术。如表1所示，相较于单独培养，利用微藻的两阶段培养技术所得油脂产率大幅提升。
1.1.2耦合废水处理的两阶段培养产脂技术
1.1.3基于代谢转换的两阶段培养产脂技术
微藻可以采用不同的培养模式进行生长,如光自养、异养或混合营养。光自养是一种有效的转化方式,但在经济上难以实现商业化。在自养模式中,微藻通过光合作用将简单的无机营养物质转化为原料。光照是决定微藻自养生长的重要决定因素。在培养初期,培养液中微藻的生物量浓度低,细胞数目少,光可以穿透培养液,使微藻充分地进行光合作用;而在培养的中后期,由于微藻的生物量浓度增大,细胞数目增多,光线被遮蔽从而导致大量微藻细胞难以获得充足的光照,影响了光合作用的进行,此时若将微藻细胞收集起来并转移到第1阶段进行异养或混合营养培养则可以继续保持较高的生长速率。微藻的这种自养异养两阶段培养技术,由于后期使用哢养或混合营养培养从而减少了微藻对光的需求,可以持续获得大量微藻生物量。此外，与异养相比,在混合营养模式下通常可以获得更高的微藻生物量及油脂含量。学者考察了两种不同模式(自养混合营养和自养异养)下普通小球藻(C.vulgaris)的培养效果,发现自养混养模式比自养异养模式表现出更高的油脂产率。
1.1.4基于应激诱导剂的两阶段培养产脂技术
植物激素可以降低细胞氧化损伤促进生长,也可以通过调控细胞代谢进而影响油脂合成。将植物激素(黄腐酸、水杨酸、茉莉酸、富里酸和脱落酸等)与微藻的两阶段培养技术耦合可以获得更好的生物质和油脂产量。例如,利用异养缺氮模式培养单针藻(Monoraphidiumsp.),于第I阶段缺氢培养过程中添加褪黑素,褪黑素可以抑制微藻胞内活性氧的产生,进而缓解缺氮对生长的抑制作用,使其油脂产量提高1.22倍。在单针藻(Monoraphidiumsp.)FXY-10的异养光自养培养模式的第I阶段光自养过程中添加富里酸,可将单针藻的油脂产率从未添加前的43.06mg/(Ld)提高至120.79mg/(L:d)。此外,蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)、莱茵衣藻(Crenhardti)等藻株在高盐度环境下也会合成油脂。在第I阶段培养过程中,通过添加NaCI进行盐胁迫可以有效促进产脂,但外源添加植物激素或NaCI的养殖用水排放后会增加对环境产生的负面影响。
1.2淀粉
目前已有部分研究使用微藻的两阶段培养技术生产淀粉。利用两阶段培养技术培养小球藻(Chlorellasp.)AE10生产淀粉,通过在第邛阶段使用缺氮、高光和高浓度CO2,将细胞内的淀粉含量提高至60.3%,其两阶段培养的淀粉产率达311mg/(Ld)。在第I阶段提供的有利生长条件下,获得较高的盐生小球藻(Chorellasalina)生物量,随后在第I阶段通过氮硫限制来增强盐生小球藻(C.salina)淀粉的积累。培养结束后,其两阶段培养体系中盐生小球藻(C.salina)的淀粉浓度达3051mg/L,远高于相同培养参数下单阶段培养中的淀粉浓度16.77mg/L。这表明两阶段培养淀粉生产的策略强调物理化学生长条件的控制。未来可以进一步探索使用多种代谢模式或培养系统的策略,并通过基因工程的手段抑制淀粉降解酶，以实现最大化淀粉生产的目标。
1.3氢气
利用微藻两阶段培养技术生产其他高值产品
2.1虾青素
尽管雨生红球藻(Hpluvialis)胞内虾青素含量较高,但其生长速率较慢,使得在培养过程中存在污染风险。佐芬根色绿球藻(Chlorellazofingiensis)分裂较快,其污染风险较小,并且可以合成一定量的虾青素。学者利用两阶段培养技术培养佐芬根色绿球藻(Czofingiensis)生产虾青素,结果表明两阶段培养的虾青素产量比传统分批培养法提高了74%。此外,Zhang等173]采用光生物反应器,利用异养稀释光自养的方法培养佐芬根色绿球藻(Czofingiensis)生产虾青素,其最终虾青素产率达到5.24mg/(Ld),高于采用同样培养方法的雨生红球藻(H.pluvialis)的虾青素产率4.4mg/(L-d)I74]。这些研究表明,佐芬根色绿球藻(C.zofingiensis)在两阶段虾青素生产中有可能替代雨生红球藻(H.pluvialis)。
2.2β-胡萝卜素
2.3叶黄素
2.4多不饱和脂肪酸
利用微藻两阶段培养技术前景分析
通过两阶段培养技术能够同时获得较高的微藻生物量和产物得率,是提升微藻产品得率的有效手段。但相较于一步培养法,两阶段培养技术需要更多的系统单元和操作步骤,工艺流程相对复杂,待优化的技术环节增多,进而增加了相应的生产成本。例如,添加应激诱导剂会增加化学成本,将第I阶段培养液中的藻细胞转移至第I阶段培养过程中会增加离心和泵送成本。因此,在构建商业化两阶段培养过程中要进行全面的技术经济分析,确定两阶段培养系统的产量优势是否可以抵消相应的生产成本。
通过将两阶段培养技术与废水处理相结合,利用废水作为营养源，可以降低两阶段培养的生产成本。废水(无有机碳源)可用于促进光养微藻的生长,而含有有机碳的废水可用作混合营养/异养培养基中的营养源。此外，含有CO2和有机气体的工厂烟气也被认为是微藻生产过程中的经济选择。学者发现在两阶段培养模式中利用CO2培养微藻不仅可以获得更高的生物质产率,还能增强废水中有机物质的去除能力。据报道,利用烟气中的CO2可以降低19%-39%的成本，而同时利用废水和烟气则可将生产成本降低35%-86%。尽管目前针对微藻的两阶段培养技术已经开展了较为广泛的研究,但目前该技术的应用仍存在一些瓶颈。
结论
[1]吴朋徽,刘耀,张磊,等.微藻两阶段培养技术研究进展[J].微生物学通报,2024,51(01):1-16.DOI:10.13344/