利用CRISPR/Cas9技术对调控水稻产量千粒重基因TGW6定点编辑,获得了一套有重要育种价值的tgw6突变体。设计了分别由U3、U6a和U6b启动子驱动、长20bp的guideRNA(gRNA)靶点以靶向编辑TGW6基因的外显子,首先将这3个靶点一起组装到pYLCRISPR/Cas9-MT(I)载体上,然后利用农杆菌介导侵染水稻材料H447(R819/玉针香//R819的BC3F6);提取T0代转基因植株的基因组DNA并对编辑位点附近的DNA片段进行PCR检测及测序分析。结果表明,T0代材料中tgw6的突变频率高达90%,其中纯合缺失突变率约占51%。对T1代纯合缺失突变体的千粒重性状的调查分析结果表明,部分tgw6的缺失突变能显著提高千粒重(大于5%)。不同类型tgw6突变体的成功创建不仅丰富了tgw6的变异类型,为水稻的高产稳产奠定了重要的材料基础,还证实了CRISPR/Cas9技术在水稻基因工程育种中高效、易操作的特点。
Asetoftgw6(Thousand-grainweight6)mutantswereconstructedusingCRISPR/Cas9technologyinthisstudy.Threesitesof20ntguideRNA(gRNA)targetedtotheexonofTGW6weredesignedandtranscribedfromtheU3,U6a,orU6bpromoters,respectively.ThethreetargetsitesofgRNAwerethenligatedtothevectorpYLCRISPR/Cas9-MT(I)basedongoldengatecloningstrategy.Therecombinantplasmidwastransferredtoaricecultivar,H447(R819/Yuzhenxiang//R819BC3F6)byAgrobacterium-mediatedtransformation.SequencingforthegenomicDNAofTGW6locusinT0riceshowedthemutagenesisfrequencyforTGW6wasmorethan90%,including51%ofhomozygousdeletionmutations.FurtheranalysisfortheT1mutantsshowedthatalmostallthehomozygousdeletionmutantsimprovedthethousand-grainweightsignificantly(morethan5%).Thesuccessfultgw6editingnotonlyprovidedaseriesoftgw6mutantsforhighandstableyieldofricebutalsoprovedthatCRISPR/Cas9isafacileandpowerfulmeansofricegeneticengineeringforscientificandagriculturalapplications,whichhasimportanttheoreticalandpracticalsignificanceforricebreeding.
水稻材料H447为籼稻恢复系R819与优质米常规籼稻品种玉针香杂交后,以R819为轮回亲本回交、自交得到的BC3F6代品系。该品系具有抗稻瘟病、株型紧凑、米质优等特点。Cas9载体pYLCRISPR/Cas9-MT(I)及gRNA载体pYL-U3/U6a-b-gRNAs(图1)由华南农业大学刘耀光研究员馈赠。
采用CTAB法提取T0代再生水稻植株的叶片,对潮霉素基因检测为阳性的植株利用引物Cas9-TGW6testF及Cas9-TGW6testR对tgw6编辑位点上下游200bp左右区域DNA片段进行PCR扩增。电泳结果(图5-A)表明,扩增产物中多为tgw6片段缺失纯合体,也有部分双等位杂合突变体存在。进一步对扩增产物的测序分析表明(图5-B),tgw6突变频率高达90%,其中51%为片段缺失纯合体(缺失片段长度均在100bp以上),39.5%是双等位杂合突变体。
为进一步获得无T-DNA插入元件的tgw6突变体,将T1代tgw6缺失纯合突变的种子播种成苗,苗期利用引物hphF与hphR对潮霉素基因进行PCR检测。结果表明,T1代转基因苗中潮霉素基因的分离符合孟德尔定律(数据未列出),图6中列出了对部分tgw6突变体潮霉素基因PCR检测的结果,以进一步对这些材料进行千粒重性状的分析。对T2代种子千粒重调查结果表明(表2),所分析的5种类型的纯合缺失突变都显著提高了水稻的千粒重(大于5%)。
获得了类型较为丰富(多碱基缺失、插入等)的tgw6突变体,为进一步应用于水稻的高产、稳产育种奠定了重要材料基础。为快速创建稻米品质(fgr、Chalk)、雄性不育(tms5)等生产上有重要应用价值的水稻优异新种质提供了重要参考,并有望为水稻种质资源创新提供安全、高效的新途径,具有重要的理论和实践意义。
致谢:感谢华南农业大学刘耀光研究员提供的pYLCRISPR/Cas9-MT(I)及gRNA载体(pYL-U3/U6a-b-gRNAs)。