本发明涉及生物技术和农业领域，具体涉及一种利用水稻籼粳亚种间杂交/加倍的四倍体重组自交系进行育种的方法。
背景技术：
水稻作为重要的主粮作物之一，供养全球一半以上的人口，其产量和品质对维护全球粮食安全至关重要。为了获得具有高产、抗逆性强以及稻米品质高、口味好的水稻品种，育种家们通过各种水稻育种手段来培育水稻新品种并扩大水稻种质资源。现有的水稻育种方法包括杂交育种、诱变育种、航天育种以及转基因育种等，以上每一种水稻育种方法都获得了巨大成功，但同时也各存在一定的局限性，列举如下：
诱变育种：是指通过化学试剂(如ems)、物理射线(γ射线等)处理水稻种子，诱发基因组突变以及表型变异，并从突变体中筛选优良的水稻品种。其局限性包括：a,化学试剂或物理射线诱发的有利变异少，需使用大量水稻种子进行处理；b,诱变的方向和性质无法控制，成功率低；c,改良数量性状效果较差，通常造成基因组单基突变(点突变)，对数量性状的影响较小。
航天育种：是指利用返回式卫星或宇宙飞船将水稻种子或无性繁育株系带到离地球200～400km的太空环境，利用外太空的微重力、宇宙射线、高真空、弱磁场和太阳离子等诱导植物种子或材料发生可遗传的变异，经选育或选配育成水稻新品种的育种方法。其局限性包括航空诱变需要借助返回式卫星或宇宙飞船，机会实在难得。
转基因/基因编辑育种：是指通过转基因/基因编辑手段对已有的水稻品种进行改良操作，使其具有相应更好表现的育种方法。其局限性包括：a,由于水稻基因编辑技术涉及到愈伤组织诱导及再生过程，因此只适用于一部分能够成功诱导愈伤组织和再生的水稻品种；b,针对目标性状，需要掌握其遗传基础(例如，需了解控制其的基因)，而对遗传基础不清晰的性状改良很难；c,转基因/基因编辑作物在国内控制严格，距离实际生产应用还有一段距离。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种新的水稻育种方法。
第一方面，本发明要求保护获得具有目的性状的水稻育种材料的方法。
本发明所要求保护的获得具有目的性状的水稻育种材料的方法，可包括如下步骤：
(a1)将籼稻与粳稻杂交，得f1代杂交种(当代不育，二倍体)；
(a2)将(a1)所得f1代杂交种加倍为四倍体；
(a3)将(a2)所得四倍体连续多代自交，从所得四倍体重组自交系中选择具有所述目的性状的四倍体重组自交系；
(a4)将(a3)所得具有所述目的性状的四倍体重组自交系进行染色体组减倍，得到具有所述目的性状的二倍体；所述二倍体即为具有所述目的性状的水稻育种材料。
在步骤(a1)中，所述籼稻可为任何籼稻品种；所述粳稻可为任何粳稻品种。在本发明的具体实施方式中，所述籼稻具体为籼稻品种93-11；所述粳稻具体为粳稻品种日本晴。
在步骤(a1)中，所述将籼稻与粳稻杂交既可为正反两方向杂交，也可为单方向杂交，谁父本谁母本均可。
在本发明的具体实施方式中，所述将籼稻与粳稻杂交为籼稻品种93-11和粳稻品种日本晴正反两方向杂交，得到正反两个方向f1代杂交种。
在步骤(a2)中，将所述f1代加倍为四倍体可通过任何现有技术手段实现。在本发明的具体实施方式中，将所述f1代加倍为四倍体具体是利用秋水仙素进行加倍的。
在步骤(a3)中，所述四倍体重组自交系可为自交8代以上的四倍体重组自交系。在本发明的具体实施方式中，所述四倍体重组自交系具体为自交15代的四倍体重组自交系。
进一步地，在本发明的具体实施方式中，所述自交15代的四倍体重组自交系是按照如下获得的：自交1代、自交2代、自交9代以及自交9代以上均为单粒法，其余代次为等粒传代法(即每个株系选择相同种子粒数向下传代，以便保证后代材料为随机群体)。
步骤(a4)中，可通过将具有所述目的性状的四倍体重组自交系进行花药培养得到具有所述目的性状的二倍体；也可通过将具有所述目的性状的四倍体重组自交系与水稻单倍体诱导系进行杂交，得到具有所述目的性状的二倍体。
本发明还要求保护利用所述方法获得的具有目的性状的水稻育种材料，包括完整植株、种子、愈伤组织等。
第二方面，本发明要求保护一种获得具有目的性状的水稻四倍体重组自交系的方法。
本发明所要求保护的获得具有目的性状的水稻四倍体重组自交系的方法，可包括前文第一方面所述方法中的步骤(a1)-(a3)。
本发明还要求保护利用所述方法获得的具有目的性状的水稻四倍体重组自交系，包括完整植株、种子、愈伤组织等。
第三方面，本发明要求保护如下任一应用：
(b1)前文第一方面所述方法在水稻育种中的应用。
(b2)利用前文第一方面所述方法制备得到的具有目的性状的水稻育种材料在水稻育种中的应用。
(b3)前文第二方面所述方法在水稻育种中的应用；
(b4)利用前文第二方面所述方法制备得到的具有目的性状的水稻四倍体重组自交系在水稻育种中的应用。
第四方面，本发明要求保护一种水稻育种方法。
本发明所要求保护的水稻育种方法，可包括前文第一方面所述方法中的步骤(a1)至(a4)，以及如下步骤(a5)：
(a5)将(a4)所得具有所述目的性状的二倍体作为亲本之一，与不具有所述目的性状的现有其他性状表现优良的水稻品种进行杂交，从而获得具有所述现有水稻品种遗传背景同时兼具所述目的性状的水稻新品种。
本发明还要求保护利用所述方法获得的具有所述现有水稻品种遗传背景同时兼具所述目的性状的水稻新品种，包括完整植株、种子、愈伤组织等。
在上述各方面中，所述目的性状可为任何性状。在本发明的具体实施方式中，所述目的性状具体体现为耐盐、抗冷或氮(硝态氮)利用率高(表现为氯酸盐敏感)。
实验证明，本发明所提供的利用水稻籼粳杂交及全基因组加倍获得的部分异源四倍体(segmentalallotetraploidy)重组自交系进行育种的方法，该方法能够克服籼粳杂种f1代不育并快速且随机地诱发大量基因组变异(主要是部分同源染色体间重组交换---homoeologousexchange,he，也包括其他类型的遗传及表观遗传变异)及表型(包含抗逆性)多样性的特性，在连续自交15代后(经验看8-10代后基本系内表型稳定)，选择具有优良目的性状的四倍体重组自交系，将其进行花药培养恢复至与其具有相同基因组组成(genomiccomposition)的二倍体水稻，从而达到扩大水稻种质资源和应用于育种的目的。利用水稻籼粳品种间明显的杂种优势，克服f1杂种不育，因此该四倍体自交多代后的重组自交系中he分布会相对于二倍体水平的重组自交系中更均匀、广泛，相应基因组变异更多，表型多样性更为突出。本发明对于水稻育种具有重要意义。
附图说明
图1为pcr鉴定n9、9n杂交种。n9表示粳稻日本晴(n)作为母本，籼稻93-11(9)作为父本杂交获得的二倍体f1杂交种；9n表示籼稻93-11(9)作为母本，粳稻日本晴(n)作为父本杂交获得的二倍体f1杂交种。npb表示粳稻日本晴；mix表示将日本晴和籼稻93-11的dna进行1:1(摩尔比)混合的模拟杂交种样本。上图为引物对mpl-4检测结果，下图为引物对mpl-5检测结果。
图2为细胞学鉴定加倍后水稻材料的染色体数目结果图，图片展示为四倍体水稻染色体数目为48条的示意图。
图3为本发明512个水稻籼粳间节段异源四倍体重组自交系(s15代)的传代流程模式图。该套材料在s9代时开始进行连续6代的单粒传代最终获得s15代独立的重组自交系。不同颜色代表不同单株(早代个体)或不同系(四倍体重组自交系)间存在着由减数分裂过程中部分同源染色体重组多导致的基因组差异。虚线箭头表示在实际传代过程中有自交传代但未在模式图中画出。
图5为水稻籼粳亚种间节段异源四倍体部分重组自交系(s15)与其二倍体双亲日本晴(npb)、93-11的表型展示图。a，整体株型；b，剑叶角度；c，剑叶长度及宽度；d，种子长度及宽度；e，结实率。e图中穗子下方两排种子从上到下分别是饱满的实粒和败育的瘪粒。
图6为boxplot展示该套籼粳亚种间四倍体重组自交系(s15)的表型特征，从上到下分别是株高、有效分蘖数目、茎秆直径和分蘖角度四个表型，l1-l10为随机选取的10个四倍体重组自交系(s15)。
图8为柱形图展示使用第一种盐处理方法，水稻日本晴(npb)、93-11和对应图7中的4个四倍体重组自交系(s15)在正常培养条件下和盐胁迫后的平均存活率。
图11为柱形图展示使用4℃冷处理方法，水稻日本晴(npb)、93-11和对应图10中的4个s15代四倍体重组自交系在正常培养条件下和冷胁迫后的平均存活率。
图13为柱形图展示使用2mm氯酸钾(kclo3)处理方法，水稻日本晴(npb)、93-11和对应图12中的4个s15代四倍体重组自交系在正常培养条件下和氯酸盐胁迫后的平均存活率。
图14为本发明使用的花药培养技术的流程示意图和四倍体重组自交系第18系(s15-18-4x)与由其花药培养获得的相应二倍体再生系(s15-18-2x)。a为花药培养技术的流程示意图；b为四倍体重组自交系第18系(s15-18-4x)与由其花药培养获得的相应二倍体再生系(a-18-2x)表型图。
图15为利用双色寡核苷酸探针荧光原位杂交(oligo-fish)技术鉴定水稻核型示意图。a，双色oligo-fish探针在水稻12条染色体上分布模式图；b，双色oligo-fish技术应用于二倍体水稻的染色体排布图；c，利用双色oligo-fish技术鉴定水稻第18系四倍体重组自交系(s15-18-4x)为整倍体的示例图；d，利用双色oligo-fish技术鉴定水稻由第18系四倍体重组自交系(s15-18-4x)花药培养出的再生植株为二倍体整倍体(a-18-2x)的示例图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、利用水稻籼粳亚种间杂交/加倍的四倍体重组自交系进行育种
本实施例通过将籼稻代表品种93-11和典型粳稻日本晴进行正反向杂交，并通过秋水仙素处理正反向f1杂交种幼芽进行全基因组加倍成功创制了一套水稻籼粳亚种间异源四倍体，通过连续15代的自交繁育，获得了512个s15代独立的水稻籼粳亚种间节段异源四倍体重组自交系(下面简称水稻四倍体重组自交系)，从中随机选取38个具有不同目的性状(如耐盐、抗冷或氮利用率高等)水稻四倍体重组自交系进行花药培养，获得可育二倍体，并验证二倍体是否具有稳定的目的性状。
一、杂交过程，正反交f1杂交种的获得
利用分子手段pcr技术鉴定杂交种，去除伪杂种。日本晴和93-11两个水稻品种存在基因组序列上差异，我们利用两品种间转座元件mping(mping是水稻中普遍的mite类dna转座子)的插入多态性(是指在基因组某一特定位置，日本晴中有mping的插入，而93-11无mping插入；或者反之。其中，在野生型日本晴基因组中大概有53个mping插入位点；在野生型93-11基因组中大概有10个mping插入位点)特点，选取10个日本晴和93-11存在mping插入差异的基因组位点，分别在转座子mping上和其插入侧翼序列上设计引物(10对引物命名为mpl-1---mpl-10，具体引物序列见表1)(wangh,chaiy,chux,etal.molecularcharacterizationofaricemutator-phenotypederivedfromanincompatiblecross-pollinationrevealstransgenerationalmobilizationofmultipletransposableelementsandextensiveepigeneticinstability.bmcplantbiology,2009,9(1):63-63.)。图1展示为其中两对引物(mpl-4和mpl-5)的pcr结果，在杂交种中，分别有日本晴和93-11的两条条带，为真正杂种，否则为伪杂种。
表110对mping插入位点引物序列信息
二、秋水仙素加倍
1、秋水仙素溶液的配制：通风橱内先用无水乙醇适量溶解秋水仙素固体(一般2ml无水乙醇溶解1g秋水仙素固体)，然后在超净台中使用孔径为0.38μm的滤膜对秋水仙素溶液进行抽滤灭菌，使用灭过菌的ro水(去离子水)配制浓度为0.2％(即2g/l)的秋水仙素液体(ro水+秋水仙素)。
2、对步骤一获得的正反交f1杂交种进行无菌操作发芽：剥掉残余种皮，将种子倒入灭过菌的锥形瓶中，先用75％酒精清洗种子表面30s，灭过菌的ro水清洗两次，次氯酸钠消毒液浸泡10-12mins，灭过菌的ro水清洗3-4次，随后用灭过菌ro水浸泡发芽，待杂交种破胸发芽后(刚刚发出<0.5cm)，加入适量(浸没发芽种子即可)步骤1配制好的秋水仙素处理液，浸泡三天，每天超净台内更换处理液。
3、配制1/2ms种子培养基(无蔗糖)，将清洗数次后种子种在培养基中，待后续观察。
4、待培养基中水稻幼苗长至顶盖，将其开盖炼苗2-3天，后移至土中培养。
5、待加倍植株生长至成熟期，观察其种子表型并将种子暗培养至生根，根长在1-1.5cm时取其根尖进行普通细胞学鉴定。
细胞学鉴定加倍后水稻材料的核型如图2所示，图片展示为四倍体水稻染色体图中水稻48条染色体示意图。
经验证该步骤成功获得两个方向的s0代四倍体(nn99是指日本晴做母本，93-11做父本杂交获得的f1杂交种全基因组加倍后获得的四倍体材料、99nn是指93-11做母本，日本晴做父本杂交获得的f1杂交种全基因组加倍后获得的四倍体材料)。
三、自交传代过程
将步骤二得到的两个方向的s0代四倍体(nn99、99nn)，分别按图3方式进行连续多代自交，每年分别在天津和海南两地进行育种繁育后代(准备好的种子育秧，待培育30-40天左右，送至田间插秧)并控制其进行自交，经过15代连续自交，得到512个四倍体重组自交系。
1、该步骤中，本发明的发明人对四倍体重组自交系的32个直接祖先个体(图3中的s6代)进行全基因组重测序(wholegenomere-sequencing)，发现32个受测样品间存在着大量的部分同源片段相对拷贝数差异，表明有大量的homoeologousexchanges(hes)的发生，也暗示着四倍体重组自交系间将存在着巨大的染色体排布(rewiring)差异。
2、该步骤中，发现512个水稻四倍体重组自交系(s15)在群体水平表现出系间表型多样性。
本发明的发明人连续两年(2018、2019)在同一种植地点(天津宝坻区)对这512个水稻四倍体重组自交系(s15)在群体水平(每系选择30-40单株)进行了多达21个水稻农艺性状的测量，表型调查结果表明，这些水稻四倍体重组自交系内个体间表型已经高度一致，但系间存在着巨大的表型多样性(图5和图6)。
21个测量的水稻农艺性状包括：花期、株高、剑叶长度、剑叶宽度、剑叶角度、最大分蘖角、茎秆直径、有效分蘖数、穗长、一次枝梗数目、二次枝梗数目、每穗颖花数、每穗实粒数、每穗颖花密度、结实率、千粒重、单株产量、种子长度、种子宽度、种子长宽比、单株地上生物量。
3、该步骤中，发现有些水稻四倍体重组自交系(s15)具有很强的抗逆性。
(1)强耐盐性
本发明的发明人对随机选取的(也是用于下一步骤花药培养的)38个水稻四倍体重组自交系(s15)及其二倍体双亲日本晴和93-11群体进行了两种不同的盐胁迫处理，每种盐胁迫处理进行了三次独立实验。
第一种盐胁迫的方法是待实验材料长至三叶一心期，转移至含有150mmnacl的水稻营养液中培养7天，随后再转移到正常水稻营养液中恢复7天。三次独立盐胁迫实验结果均表明，各个实验系在对照条件下均生长良好，而在该盐处理强度下，二倍体水稻亲本日本晴和93-11以及大部分水稻四倍体重组自交系均已彻底死亡，而有5个重组自交系(编号为：系3，系12，系18，系21和系31)表现出了极强的耐盐性，且在盐胁迫恢复后可正常自交结实；同时在胁迫过程中，发明人也发现了12个对盐胁迫极为敏感(很早就出现胁迫表型并迅速死亡)的水稻四倍体系，通过缩盐短处理天数发现，这些盐胁迫敏感系的耐盐性强于其二倍体亲本93-11但弱于日本晴(图7和图8)。以此推测，从512个水稻四倍体重组自交系中至少能筛选到60个盐抗性系以及160个盐敏感系。
(2)抗冷
本发明的发明人对上文随机选取的(也是用于下一步骤花药培养的)38个水稻四倍体重组自交系(s15)及其二倍体双亲日本晴和93-11群体进行了三次独立的冷胁迫处理实验。待实验材料在正常的水稻营养液中长至三叶一心期，转移至4℃培养箱中进行为期三天的冷胁迫处理，随后再转移到25℃人工气候室中恢复7天。三次独立冷胁迫实验结果均表明，各个实验系在对照条件下均生长良好，而在4℃冷处理胁迫下，二倍体水稻亲本93-11以及大部分水稻四倍体重组自交系均已彻底死亡，而有6个重组自交系(即表2中编号为：系3，系8，系14，系18，系26，系33)出现了与亲本日本晴相同的冷抗性，且在冷胁迫恢复后可正常自交结实；同时在胁迫过程中，本发明也发现了10个对冷胁迫极为敏感(很早就出现胁迫表型并迅速死亡)的水稻四倍体重组自交系。图10和图11以系3和系14两个抗性系、系27和系38两个敏感系为例分别对胁迫后表型及存活率进行展示。以此推测，从512个水稻四倍体重组自交系中至少能筛选到80个冷胁迫抗性系以及130个冷敏感系。
(3)氮利用率提高(耐低氮胁迫)
本发明的发明人对上文随机选取的(也是用于下一步骤花药培养的)38个水稻四倍体重组自交系(s15)及其二倍体双亲日本晴和93-11群体进行了三次独立的氯酸盐胁迫实验。氯酸盐(使用药品为氯酸钾，kclo3)是硝酸盐的毒性类似物，可以被硝酸盐转运蛋白吸收，进而在硝酸还原酶的作用下转化为对植物具有毒害作用的次氯酸盐。待实验材料在正常的水稻营养液中长至一叶一心期，转移至含有浓度为2mm氯酸钾的无氮营养液中培养4天，随后再转移到正常水稻营养液中恢复7天。三次独立氯酸盐胁迫实验结果均表明，各个实验系在对照条件下均生长良好，而在氯酸钾处理下，二倍体水稻亲本93-11以及大部分水稻重组自交系均已死亡，仅有5个系(即表2中编号：系7，系15，系25，系32，系38)表现出较强的氯酸盐敏感性，表明对硝态氮的利用率较高，同时在胁迫过程中，本发明也发现了9个对氯酸盐表现出抗性，表明对硝态氮的利用率较低(图12和图13)。以此推测，从512个水稻四倍体重组自交系中至少能筛选到60个氮利用率高的系以及120个氮利用率低的系。
四、花药培养过程
(1)花药取材：将二倍体亲本日本晴、93-11以及步骤三中从512个四倍体重组自交系(s15)中随机选取的38个水稻四倍体重组自交系(编号为系1-系38)水稻种子于试验田播种，在7-8月份，水稻孕穗期，一般在晴天的上午8︰00-10︰00或下午16︰00-18︰00，此时细胞处于旺盛的分裂期。在剑叶与下一叶的叶枕距为10cm左右时取幼穗，这时花药大小大概是颖壳的1/3，显微镜观察花药此时处于单核靠边期；单核靠边期是水稻花药培养的最佳时期。花药过老或过嫩，都会影响愈伤的诱导率。取回的幼穗用保鲜膜包裹好后放在4℃冰箱中进行低温预处理，低温预处理是提高花培效率最常规有效的手段，可使水稻愈伤组织诱导率提高几倍至几十倍。低温处理的作用机制是延缓花粉的退化、维持花粉发育的生理环境、提高内源生长素水平、降低乙烯含量、启动雄核发育等。保存7-14天后取出，在超净工作台中进行下一步实验。每个株系下取(不区分单株)：20-30个幼穗。
(2)花药培养：在超净工作台中准备如下物品：酒精灯，75％乙醇，次氯酸钠(安替福民)，灭菌的去离子水，剪刀，镊子，培养皿，灭菌的滤纸，灭菌的烧杯，废液缸，水稻花培愈伤组织诱导培养基(固体)。
水稻花培愈伤组织诱导固体培养基(1l)配方如下，其中，①是大量元素，②是微量元素，③是铁盐，④是有机药品，⑤是激素；⑥-⑩是其他必须步骤或药品：
花药培养具体操作过程如下：
在超净工作台中，用剪刀将水稻颖壳底部(小心避免剪到花药，目的是剪断花药丝，使花药可轻易抖出)剪开，用镊子夹住颖壳顶部，将花药抖落在水稻花培愈伤组织诱导培养基中央，每瓶中大概分装500个花药，封口后标记好株系和日期，于25℃暗培养条件下诱导愈伤组织。25天左右，分生出愈伤组织，这时将愈伤组织转移至新的水稻花培愈伤组织诱导培养基中，继代培养1-2次，移至水稻再生培养基中，放在32℃持续光照培养箱中，12000lx光照强度下诱导分化。大概20-25天左右愈伤会分化出绿苗，继续在光照培养箱中培养，待再生出的幼苗长至顶盖高度，将培养瓶盖子打开，炼苗1-2天，后将幼苗放在水稻营养液中于人工气候室(恒温25℃，光照12000lx)培养，每天更换一次营养液(花药培养各步骤图片详见图14)。培养5-7天左右取根尖利用细胞学方法鉴定材料倍性，利用双色oligo-fish技术进行二倍体恢复系水稻核型鉴定。
五、花药培养实验结果
花药培养使用水稻花培愈伤组织诱导培养基，步骤三中从512个四倍体重组自交系(s15)中随机选取的38个水稻四倍体重组自交系(编号为系1-系38)中有25个系成功获得与其具有相同基因组嵌合组成的二倍体恢复系，具体的愈伤组织诱导情况和分化出苗情况见表2。
表2花药培养愈伤组织诱导情况和分化出苗情况统计表。
注：√表示成功；×表示失败。
六、经花药培养获得的二倍体水稻系抗逆性鉴定
1、一些四倍体重组自交系(s15)具有强耐盐性，且其经花药培养获得的二倍体水稻系也遗传了其强耐盐性。
对经步骤三鉴定具有强耐盐性的四倍体重组自交系(s15)通过花药培养获得的与其具有相同基因组组成的二倍体水稻系进行与四倍体重组自交系一样强度的盐胁迫鉴定。(盐处理方法与步骤三中描述的第一种盐处理方法完全一致)实验证明，这些盐胁迫抗性系通过花药培养获得的与其具有相同基因组组成的二倍体水稻系可继承其相应亲本四倍体重组自交系的强抗盐特性。以s15-18四倍体系(s15-18-4x，即表2中的系18)与其相应花药培养二倍体系(a-18-2x)作为例子，其盐胁迫展示图见图16。
2、一些四倍体重组自交系(s15)具有强抗冷性，且其经花药培养获得的二倍体水稻系也继承了其强抗冷性。
对经步骤三鉴定具有强抗冷性的四倍体重组自交系(s15)通过花药培养获得的与其具有相同基因组组成的二倍体水稻系进行四倍体重组自交系一样强度的抗冷性鉴定。(冷处理方法与步骤三中描述的冷处理方法完全一致)。实验证明，这些盐胁迫抗性系通过花药培养获得的与其具有相同基因组组成的二倍体水稻系可继承其相应亲本四倍体重组自交系的强抗冷特性。以s15-3和s15-14两个四倍体系(s15-3-4x和s15-14-4x，即表2中的系3和系14)与其相应花药培养二倍体系(a-3-2x和a-14-2x)作为例子，其冷胁迫展示图见图17。
3、一些四倍体重组自交系具有更高的氮利用率(氯酸盐胁迫)，且其经花药培养获得的二倍体水稻系也遗传了其高氮利用率特性。
对经步骤三鉴定具有高的氮利用率(氯酸盐胁迫)的四倍体重组自交系(s15)通过花药培养获得的与其具有相同基因组组成的二倍体水稻系进行高的利用率(氯酸盐胁迫)鉴定(氯酸盐处理方法与步骤三中描述的氯酸盐处理方法完全一致)。实验证明，这些氮利用率高的系通过花药培养获得的与其具有相同基因组组成的二倍体水稻系可继承其相应亲本四倍体重组自交系的高效率氮利用特性。以s15-7和s15-15两个四倍体系(s15-7-4x和s15-15-4x，即表2中的系7和系15)与其相应花药培养二倍体系(a-7-2x和a-15-2x)作为例子，其氯酸盐胁迫展示图见图18。
上述结果表明，这些四倍体重组自交系(s15)经过花药培养所诱导出的与其基因组组成(genomiccomposition)相同的二倍体恢复系能够大部分继承其亲本四倍体的表型及抗性特征。所得具有目的性状的二倍体恢复系能够作为水稻育种材料使用。将其与不具有目的性状的现有的其他性状表现优良的水稻品种进行杂交，从而可获得具有所述现有水稻品种遗传背景同时兼具所述目的性状的水稻新品种。