导语：如何才能写好一篇成人谜语，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
一、大有人在成语谜语矢……打一成语
二、大有人在成语解析形容某一种人为数不少。《资治通鉴·隋纪炀帝大业十一年》：“帝至东都，顾眄街衢，谓侍臣曰：‘犹大有人在。’意谓向日平杨玄感，杀人尚少故也。”
三、大有人在成语造句1.只要你肯学,师傅大有人在。
2.我们这个时代,风流倜傥的青年大有人在。
3.这些人揽辔澄清、志在治国安邦的,也是大有人在。
4.像他这样的贪污犯现在大有人在。
5.在解放军战士中，能百步穿杨的大有人在。
6.像他这样爱占便宜的人大有人在。
7.旧社会，烟馆赌局到处都是，在这些伐性之斧下丧生的大有人在。
8.在中青年教师队伍中殚见洽闻之士是大有人在的。
9.至今，不相信自己，只按教条办事，像郑人买履的人还大有人在。
10.不怕你笑，我们团裡滥竽充数者大有人在。
11.穿着奇装异服招摇过市的大有人在。
12.即便是今天,小富即安、不思进取的仍大有人在,就是很好的证明。
13.一边呵佛骂祖,一边割肉饲鹰者大有人在。
14.但,修炼界之中,忌才的人也大有人在,如若无法拉拢,那就出手毁去,也不愿这样的人投入到别的势力之中。
15.但是因为分布区域狭窄,所以野生数量奇缺,捕捉出售大有人在,价格比起三棱闭壳龟,也就是俗称的金钱龟还要高昂的多。
16.武艺高强者被拜将封侯者,也大有人在。
17.再看某些知名专家学者和教授，一切向钱看，在其位不谋其政者不乏其人，滔滔不绝却不着边际者大有人在，能解决实际问题者显得弥足珍贵。
18.尽管对她那行云流水般富有表现力的动作持嘲笑态度的批评家大有人在，但伊莎多拉却为死板的古典舞蹈界带来了灵动性和自我表现力。
19.另外一家银行沈河支行的信贷员告诉记者，现在等了三四个月的大有人在，年前获得贷款的希望很渺茫。
20.早期移民到加利福尼亚的锡克教信徒与墨西哥裔美国妇女通婚甚为普遍，而第二、第三代日裔与外族通婚也大有人在。
21.可事实上世人多半受寂寞所致,着急开始,然后不了了之的人大有人在,感情犹如泛滥之河水,分文不值也。
22.麦克纳斯伯爵是紫荆花帝国名将,威名赫赫,麾下能征惯战者大有人在,武技高明的骑士多如牛毛,杜昂要学武技很方便,根本就不用到外面另请老师。
23.佩服佩服,要知道,当今天下,能做出‘百尺竿头’诗句者,大有人在,但是能做出‘百尺竿头’战诗者,少之又少。
24.齐风兴奋的说道,这三天里他们经常听到有人在不远处厮杀,一言不和便杀个你死我活的大有人在,更有甚者只是刚碰面便直接打起来的。
25.准提是善人,那和准提作对的白云就是大大的恶人了,其中中长舌男女大有人在,好事不出门,恶事传千里,一时之间牛豪恶名传遍洪荒。
26.我可是提醒过你的,交完钱跟进不进得来可是两码事,每年因为不能通过入学测验而给学院白送钱的冤大头可是大有人在。
27.藩镇将领一心保唐的在少,保存实力怀不臣之心的在多,又深惧我军之威,坚守不出的必大有人在,剩下不听劝告的,可遣大将痛击,如此一来,联军之危可解。
28.袁绍只觉得自己都快被所气爆了,这帮诸候真是成事不足,败事有余,闻功则喜,闻过则责,出谋划策未见有人,落井下石更是大有人在。
29.知道缘由后,更似已经有人开始在楚墨的背后指指点点,甚至有的破口大骂楚墨的恶劣行径了,而为徐阳抱打不平的更大有人在,局面朝着楚墨不利的情形发展着。
30.那些人倒了,但是,在他们的鼓噪声中,火中取栗者、投机取巧者、阴谋家野心家、各色残渣余孽等等,在台上的仍然大有人在。
31.阴天乐突然问道,现在田中财团内部为了继承权打得一塌胡涂,身为首位继承人的田中丽奈自然成为了多方的眼中钉、肉中刺,想必妄想要她命的大有人在。
32.还有就是到现在人们也没有形成一个统一的意见,支持两种意见的人都是大有人在,双方各抒已见争论不休。
33.民间的球迷爱屋及乌的认为蔡智的教练水平也到了国际级,希望朱广沪让出国家队主教练位置的大有人在。
释义：旧时神怪故事中形容凶神恶鬼的面貌，现形容人面貌极其凶恶。
出处：许仲琳《封神演义》第六十三回：子牙见对营门一人，三首六臂青面獠牙。
示例：鲁迅《呐喊·狂人日记》：那青面獠牙的一伙人，便都哄笑起来。
近义词：呲牙咧嘴、横眉竖眼。
1、针锋：针尖。针尖对针尖。比喻双方在策略、论点及行动方式等方面尖锐对立。
2、双方争执，寸步不让。
出处：宋·释道原《景德传灯录》卷二：“夫一切回答，如针锋相投，无纤毫参差。”
在信息技術飞速发展和世界全球化的趋势下，创造能力和创新意识是知识经济和社会发展的需要。高校是传承文化和培养人才的重要阵地，担负着为国家培养德才兼备、国际一流、适应社会经济发展需要的创新型人才的重任。如何使大学生的创新意识和创新能力得到良好的培养和训练，从而适应社会经济发展的需要，成为创新型人才，成为世界范围内高等教育研究的重要课题[1]。
现代密码学课程实践性要求很高，不仅需要掌握理论知识和前沿知识，还需要把所学的知识用到实践中去，并在应用中不断地发现问题，思考问题，解决问题[2]。传统的教学过程中，学生自始至终处于被灌输的地位，缺乏主动探索、主动发现的学习环境与空间，无法满足现代信息社会对人才的需求[3]。“任务驱动式”教学模式，即引导学生在特定的任务驱动下进行自主地探究，建构起属于自己的知识与能力。借助现代信息技术、网络技术和多媒体技术所具有的超文本特性和网络特性，基于任务驱动的教学模式改革有利于实现探究性和发现式学习，为学生发散性思维、创造性思维的发展和创新能力的培养提供了广阔的空间和便利的条件。
1现代密码学课程特点分析
⑴学科面广，知识点多
⑵教材内容陈旧，教学内容不够前沿
⑶实践性强，教学模式单一
现代密码学是一门实践性很强的课程，但是大多数院校安排课时是以理论课时为主，实践课时较少。以本校为例，现代密码学理论课时40个学时，实践课程仅有8学时。学生缺乏自己动手实践的机会，普遍反映学习算法时比较吃力，比如RSA，DES，AES，ELGamal等算法原理在课堂上都能听懂，但真正上机编写却无从下手，在实际中不知如何应用。
因此，针对现代密码学的课程特点，以任务驱动引导学生自主探究学习，强调学生的主体作用，有助于提高学生的学习兴趣。把理论与实践课程相结合，注重实践环节，加强学生实践能力的培养，可以让学生更好地了解所学内容的实用价值。培养学生主动学习、独立思考以及团队合作的能力，从而提高教学质量。
2教学内容任务设计
现代密码学包括古典密码、序列密码、分组密码、公钥密码、杂凑函数、数字签名及密钥管理等基础内容，涉及内容比较多。将现代密码学整个知识结构理清，认清各个章节的内在联系，将大大提高效率。整体上以理论教学为引导，注重任务和实践，将知识设计在一个或几个任务之中，并且各个任务之间能有一定的联系，帮助学生理清整体知识结构。基于任务驱动的教学模式目标在于充分体现“教师主导作用，学生主体作用”的教学理念，引导学生发现问题、分析问题、解决问题。
3基于任务驱动的教学方法实施
教学内容实施过程中，重在发挥学生的主体作用，通过启发引导、自主探究、协作交流、总结提高等具体的实施，提高学生自主学习能力。
启发引导。课堂内容与任务确定后，需要教师对任务场景进行分析，向学生提出若干启发性的问题，引导学生深入思考，使学生快速找到问题的切入点，对问题进行分解、自主分析，提出解决方案。这个环节，教师的角色由传统的“授”转变为“引”，需要教师作好充分的准备工作，摸清楚学生的学习状态、认知能力、兴趣爱好等基本特点，以学生积极接受的方式引导学生。
自主探究。该环节是基于任务驱动教学模式的重要环节，教师仅仅负责提供资料，由学生自主探讨、解决访问的方法，学生可以利用网络获取最新、最丰富的教育资源，结合Sakai网络教学平台中教学内容、多媒体教学课件、图片集、教学视频、学生作品等教学资源，将收集到的资料整理、消化、吸收、转化为自己的东西，找出完成任务的最佳解决方案。该环节有助于增强学生自主学习意识，培养学生的主动创新精神，挖掘学生的挑战能力。
4课程考核方式改革
传统的课程考核方式通常是试卷，忽视了学生学习的过程。基于任务驱动的考核方式可以多元化，通过理论考试、实验评价、过程考核等方式，考察学生对整门课程的掌握程度。这种多元化的评价模式，避免了片面的以学习结果评价学生的能力，全方位的考察学生整体水平，促进学生整体素质的提高。
理论考试，重点考察学生对课堂上的理论知识点掌握情况，包括密码算法的基本原理、应用等。实验评价，是对学生完成任务的情况进行评价，考虑是否按规定独立完成或者团队合作完成、是否提交研究报告等因素进行评价。过程考核，是对学生在整个教学活动各个环节的表现给予评价，比如能否积极的思考并提出问题，能否自主地搜索资料，能否创新的解决问题，团队合作中所表现出来的协作能力，表达能力，执行能力等等。
5总结
现代密码学是一门理论与实践并重的多学科交叉的课程，其实践教学涉及领域较广，要求也相对较高。现代密码学课程教学模式的改革，将对信息安全发展、课程建设及人才培养产生积极意义。本文主要从教学内容设计、教学方法实施和考核评价三部分着手，结合现代密码学的课程特点，探索基于任务驱动的教学模式。基于任务驱动的教学模式在密码学课程实践中取得了良好的效果，提高了学生自主探究学习的能力，拓宽了学生的专业视野，提升了学生的创新能力。希望这一教学模式的改革能对同行有借鉴作用。
参考文献（References）：
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与实践[J].微型电脑应用，2014.30（10）：32-34
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教学改革[J].计算机教育，2014.13：39-43
[3]董理君，武进霞，康晓军.信息安全专业开放式实践教学模式
探讨[J].计算机教育，2013.15：57-60
[4]张珲，王剑，刘俭.“密码学与网络安全”课程研讨式教学[J].电
气电子教学学报，2013.35（6）：63-65
【关键词】口令；对称密钥；双向；身份认证
【中图分类号】TN
【Abstract】Thispaperproposesatwo-wayidentityauthenticationschemebasedonthepasswordandsymmetrickeysystem.Undertheassumptionthatcommunicationonbothsidesforelectronicwalletclientandelectronicwalletserverapplicationenvironment，usingsymmetrickeyalgorithmimplementsmutualauthenticationbetweenthetwosidesofcommunication、thesessionkeyexchangeanduseranonymity.Finally，thesolutionofthesecurityandperformancewereanalyzed.
【Keywords】password；symmetrickey；two-way；theidentityauthentication
1引言
由于移动网络的快速发展，越来越多的人们开始使用手机等移动终端设备上网，各种电子服务与电子交易发展也十分迅速。而远程用户要获得远程服务器的服务或者进行电子交易，用户与服务器之间在开放的网络中确认双方的身份是十分重要的。为了让人们更加安全地在网络上进行交易，基于网络的安全问题已经成为信息社会急需解决的问题之一。项金萍提出的基于口令的两方认证和密钥交换协议的研究，实现了用户和远程系统的相互认证，但是因为采用了智能卡和读卡器，并不适合应用于手机等移动设备。杨a涵提出的可证安全的口令认证密钥交换协议研究，因为采用了公钥算法，对移动终端的资源需求较大。万泓伶提出的基于口令的认证系统设计与实现，运用了计算量较大的模运算。林远辉提出的基于口令的三方认证密钥交换协议研究，采用了开销较大的公钥算法。由徐会艳提出的基于口令的身份认证方案的研究，运用了开销较大的签名运算。李晓伟提出的可证明安全的认证与密钥协商协议研究，也采用了开销较大的公钥算法。本文提出的身份认证方案，因为采用了对称密钥算法，对系统资源需求较低，适合应用于手机设备等移动终端环境。
2方案设计
2.1用户注册
用户A设定使用电子钱包的账户名IDA和口令pwA。服务器将一个共享的对称密钥kA和对应IDA的匿名标识snA存入到客户A的电子钱包客户端中，服务器保存了snA与IDA及h（pwA）的映射关系，用户A下载并安装电子钱包客户端，用户不能访问存储kA和snA的区域。
2.2认证流程
方案的具体认证流程如图1所示。
（1）用户输入用户名IDA和口令pwA登陆电子钱包客户端。
（2）客户端选取随机数r1并作存储，用对称密钥kA加密r1||IDA为E（r1||IDA），把E（r1||IDA），snA打包为MA发送至服务器。
（3）服务器收到MA后，检测snA是否存在于数据库，若存在则查找对应的IDA，否则拒绝认证。通过snA查找到对应IDA的共享对称密钥kA，用对称密钥kA解密E（r1||IDA）得到r1||IDA，存储r1。服务器选取随机数r2、会话密钥k'并作存储，用对称密钥kA加密IDS||k'||r1为E（IDS||k'||r1），把E（IDS||k'||r1），r2打包为MS发送至客户端。
（4）客户端收到MS后，用对称密钥kA解密E（IDS||k'||r1）得到IDS||k'||r1，比较解密得到的随机数r1'与客户端已存储的r1是否相同，相同则存储会话密钥k'和随机数r2，否则拒绝认证。客户端用会话密钥k'加密r2||h（pwA）为M0，然后发送M0至服务器。
（5）服务器收到M0后，用会话密钥k'解密M0得到r2||h（pwA），比较解密得到的随机数r2'、h（pwA）'与服务器端已存储的r2、h（pwA）是否相同，相同则认证成功，否则拒绝认证。认证成功后，服务器更新snA为sn'A。用会话密钥k'加密IDS||sn'A为M1，然后发送M1至客户端。
3安全性和性能分析
3.1方案的安全性
性质1：认证方案可以实现会话密钥的安全交换。
证明：步骤（3）中服务器通过匿名标识snA查找到对应IDA的共享对称密钥KA，从而解密了E（r1||IDA），确认了消息MA的真实性以及用户的真实身份IDA。服务器选取会话密钥k'，用对称密钥KA加密IDS||k'||r1为E（IDS||k'||r1）传输至客户端，保证了会话密钥k'的安全传输。步骤（4）中客户端用对称密钥KA解密E（IDS||k'||r1）得到IDS||k'||r1，通过比较解密得到的随机数r'1与客户端已存储的r1是否相同，从而确认了消息MS以及随机数r1的真实性，客户端存储会话密钥k'，因此会话密钥的安全交换得以实现。
性质2：认证方案可以保证用户与服务器之间的可认证性。
证明：步骤（3）中服务器通过匿名标识snA查找到对应的IDA共享对称密钥kA，解密E（r1||IDA）得到r1||IDA，通过比较解密得到的ID'A与服务器已存储的IDA是否相同，从而确认了用户身份的真实性，用户身份得以认证。步骤（4）中客户端用对称密钥kA解密E（IDS||k'||r1）得到IDS||k'||r1，通过比较解密得到的随机数r'1与客户端已存储的r1是否相同，从而确认了消息MS以及随机数r1的真实性，服务器身份得以认证。步骤（5）中服务器用会话密钥k'解密M0得到r2||h（pwA），通过比较解密得到的随机数r'2、h（pwA）'与服务器端已存储的r2、h（pwA）是否相同，实现了用户口令的认证，因此用户与服务器之间的可认证性得以保证。
性质3：认证方案可以保证用户的匿名性。
证明：步骤（2）中客户端通过匿名标识snA隐藏用户的真实身份IDA，snA仅在用户向服务器发起认证的消息MA中。步骤（3）中服务器发给用户的应答是含有随机数r1的消息MS，除用户本人外，任何人都不知道该报文是发给谁的，保证了用户身份的机密性。步骤（5）中用户与服务器认证成功后，服务器更新snA为sn'A，因此有效地保证了用户的匿名性。
3.2性能分析
3.2.1客户端
计算开销：用H代表一次hash计算，E代表一次对称加密计算，D代表一次对称解密计算，用λ代表hash函数输出的位长。
步骤（2）中客户端用对称密钥kΑ加密r1||IDA为E（r1||IDA），需要一次对称加密计算，步骤（4）中客户端用对称密钥kΑ解密E（IDS||k'||r1）得到IDS||k'||r1，需要一次对称解密计算，用会话密钥k'加密r2||h（pwA）为M0，需要一次对称加密计算和一次hash计算，步骤（6）中客户端用会话密钥k'解密M1得到IDS||sn'A，需要一次对称解密计算，客户端的计算开销总计为H+2E+2D。
步骤（2）中客户端发送消息MΑ至服务器、步骤（4）中客户端收到消息MS、发送消息M0至服务器、步骤（6）中客户端收到消息M1需要的通信开销大致为2|r1|+|IDA|+|snA|+2|IDS|+|k'|+2|r2|+|λ|+|sn'A|。
|r1|、|IDA|、|snA|、|IDS|、|k'|、|r2|、|sn'A|分别代表r1、IDA、snA、IDS、k'、r2、sn'A的标准位长。
3.2.2服务器
步骤（3）中服务器用对称密钥kΑ解密E（r1||IDA）得到r1||IDA，需要一次对称解密计算，用对称密钥kΑ加密IDS||k'||r1为E（IDS||k'||r1），需要一次对称加密计算，步骤（5）中服务器用会话密钥k'解密M0得到r2||h（pwA），需要一次对称解密计算，用会话密钥k'加密IDS||sn'A为M1，需要一次对称加密计算，服务器的计算开销总计为2E+2D。
步骤（3）中服务器收到消息MA、发送消息MS至客户端、步骤（5）中服务器收到消息M0、发送消息M1至客户端需要的通信开销大致为2|r1|+|IDA|+|snA|+2|IDS|+|k'|+2|r2|+|λ|+|sn'A|。
4结束语
本文通过运用口令和对称密钥算法，实现了客户端和服务器的双向身份认证，不仅完成了会话密钥的安全交换，而且也保证了用户的匿名性，用户的隐私得到了有效保护。在安全性得到保障的同时，也获得了较好的性能。
参考文献
[1]项金萍.基于口令的两方认证和密钥交换协议的研究[D].杭州师范大学，2011.
[2]杨a涵.可证安全的口令认证密钥交换协议研究[D].中国矿业大学，2013.
[3]万泓伶.基于口令的认证系统设计与实现[D].电子科技大学，2013.
[4]林远辉.基于口令的三方认证密钥交换协议研究[D].山东大学，2014.
[5]徐会艳.基于口令的身份认证方案的研究[D].南京理工大学，2010.
[6]李晓伟.可证明安全的认证与密钥协商协议研究[D].西安电子科技大学，2013.
基金项目：
国家自然科学基金资助项目（61472343）。
作者简介：
1国内文秘专业建设现状分析与规律探索
1.1国内文秘专业建设现状分析
从总体来说，目前国内的文秘专业特色不明显。这主要表现在下列几个方面：
第一、培养目标雷同。目前，国内有上百所院校开办了文秘专业，大多是将文秘专业人才的培养目标定位于从事办公室事务、为领导决策服务的人才。若说有不同，有的秘书专业强化了英语教学，注重涉外秘书人才的培养。
第二，岗位定位相似。大多数秘书专业定位于各种行业从事行政秘书、涉外商务秘书、文书处理员、接待员、资料管理员、档案管理员等岗位的工作。
第三，课程体系差别不太。由于培养目标和岗位定位的相似，导致课程体系趋同。专业技能课程主要为秘书技能模块，计算机操作模块和商务模块，涉外秘书专业会有英语技能模块。
由于上述关键因素没有明显的秘书专业特色，文秘专业至今没有国家示范建设专业，省级示范建设专业也屈指可数。同时由于缺乏特色，在许多地区秘书专业学生就业出现结构性困难。
为什么文秘专业难以办出应有特色呢通过分析主要有下列几方面的原因：
第二，文秘职业的需求特点导致形成自己特色比较困难。文秘职业需求具有分散性，一个单位即使需要也往往只是一两个，不像有些专业的职业需求是批量的。职业的分散性导致文秘专业在人才培养规格上求全求大，就业岗位定位于所有行业的秘书岗位，课程体系以训练秘书岗位共性的能力为主，因此专业特色很难形成。
第三，文秘教师的现状在一定程度影响文秘专业特色的形成。目前从事文秘教学的教师多是由原来教语文或中文的教师转过来的，大多数教师没有实际秘书工作经验，对秘书岗位要求不熟悉，加上目前对秘书教师的培训机会很少，秘书专业的不“专业”，在一定程度上导致文秘专业难出彩。
1.2专业特色形成规律探索
专业没有特色就没有生存空间，没有生存空间的专业就没有竞争的优势，而没有竞争优势的专业就不能得到发展。促进专业特色的形成，已经成为许多高职院校专业获得生存和发展的重要战略手段。
通过研究那些专业特色明显的案例，我们发现，一个专业的特色形成应遵循下列规律：
①专业建设与地方经济发展趋势相一致。
专业建设方向首先要面向地方经济，为地方经济服务。因此，一个特色专业的建设必须与当地的社会背景、产业背景、职业岗位背景及其发展趋势密切联系在一起，专业建设只有把握住这种需求特点和变化趋势，有针对性地培养人才，才能实现专业和社会发展的双赢。落实在专业建设具体实施过程中，就是要对专业的培养方向、培养目标和培养模式灵活把握，随着社会需求的状况和变化确定自己的专业方向、特色和定位。比如深圳职业技术学院，由于深圳的物业管理一直走在全国前面，该学院随之设立了楼宇设备与智能化技术、制冷空调、建筑工程、城市环境工程、城市园林等物业管理专业群。再比如，伴随着深圳建设花园城市的步伐和深圳花卉园林业的发展，该学院开设了城市园林专业，等等。这些专业(群)之所以能形成特色，无不是围绕深圳的社会经济发展来建设的。
②专业建设与学院专业的整体发展规划与布局相一致。
一个专业要办出特色，需要整合院内资源，在一个学院总资源有限的情况下，如果专业建设不与学院专业的整体发展规划和布局相一致，不与本校的办学方向和学院特色相适应，就很争取到更多资源。因此，专业建设的执行者要研究本院办学特色，把握本院特色专业建设的战略方针、总体目标，然后结合自身特点将专业办出特色。比如北大方正软件技术学院，本身是一所主要培养IT人才的学院，它的文秘专业也围绕学院特色进行专业建设，目前已经成功地形成了信息化商务文秘的特色。
④专业特色的形成要充分发挥自身的优势
一个特色专业的形成是专业长期发挥自身优势的结果。比如广东科学技术职业学院文秘专业之所以能建出特色，与它长期重视发挥自身优势密切联系。该院文秘专业的专业带头人杨文丰是一位作家，同时担任该学院人文分院的领导，因此文秘专业中应用写作课程得到很好的发展，经过长期的积累与建设，该院的文秘专业写作教学获得了多项国家与省级的教学奖，同时也促成了专业特色的形成。
1.3关于我院文秘专业形成特色思考
品牌就是特色，如何将我院文秘专业建设成特色专业，我们认为，文秘专业要办出特色必须抓住深港合作机遇，结合我院的信息特点，通过提升现有的优势让本院文秘专业形成自身特点。
1.3.1关于我院文秘专业人才培养规格的定位
专业定位是专业建设的核心问题，也是专业形成特色的关键。依据专业形成特色的规律，专业定位必须立足于地方经济，为地方经济服务，同时注重专业的前瞻性。因此我们课题组认为，我院文秘专业应立足于为深圳经济发展服务。
1.3.2为培养熟悉深港企业业务运作的秘书人才所具有的条件和优势
【关键词】黑色素瘤抗原；发酵；大肠杆菌
【Abstract】AIM:TorealizehighcelldensityfermentationofMAGE3/HSP70engineeredE.coli，andtoevaluatetheantitumorimmunityofMAGE3/HSP70fusionproteininvivo.METHODS:HighcelldensityfermentationofMAGE3/HSP70engineredE.coliwascarriedoutwithconstantsolubleoxygenandcontinuouscultivationinselfcontrolfermentor.ThemousewasimmunizedbypurifiedMAGE3/HSP70fusionproteininE.coli，andtheantitumorimmunitywasdetectedbyELISPOTandLDHreleaseassay.RESULTS:HighcelldensityfermentationofMAGE3/HSP70engineeredE.coliwassuccessful，andtheexpressionofMAGE3/HSP70infermentedbacterialwasthesameastheflaskculture.TheresultsofELISPOTandLDHreleaseassayshowedthatMAGE3/HSP70generatedtumorspecificcytotoxicTlymphocyte(CTL)todamagetumorcel1.CONCLUSION:HighcelldensityfermentationofMAGE3/HSP70engineeredE.coliwasrealizedandMAGE3/HSP70fusionproteincangeneratespecificCTLtokilltumorcel1.
【Keywords】Melanomaantigen;fermentation;E.coli
【摘要】目的：实现重组人黑色素瘤抗原MAGE3/HSP70融合蛋白工程菌的高密度发酵，并测定MAGE3/HSP70融合蛋白在体内的抗肿瘤免疫效应.方法：利用自控发酵罐发酵，采用溶氧反馈，分批补料的方法对MAGE3/HSP70融合蛋白工程菌进行了高密度发酵，从菌体中纯化MAGE3/HSP70融合蛋白，并用所纯化的MAGE3/HSP70融合蛋白免疫小鼠，运用酶联免疫斑点法(ELISPOT)和细胞毒性杀伤实验(LDH)检测了融合蛋白激活机体细胞免疫反应的状况.结果：高密度发酵取得成功，发酵菌中MAGE3/HSP70融合蛋白的表达量与摇瓶中的相当，摸索出发酵水平纯化MAGE3/HSP70融合蛋白工艺，ELISPOT和LDH显示MAGE3/HSP70可以激活机体免疫反应，并产生针对MAGE3的CTL，特异性杀伤表达MAGE3的肿瘤细胞.结论：MAGE3/HSP70融合蛋白工程菌成功实现高密度发酵，MAGE3/HSP70融合蛋白可以有效激活机体免疫反应，产生针对特异性抗原MAGE3的CTL，免疫学活性良好，为新型抗肿瘤疫苗临床前研究奠定了良好基础.
0引言
黑色素瘤抗原（melanomaantigenassosiatedgene，MAGE）是第一类被发现的肿瘤排斥抗原［1-2］，MAGE3是MAGE家族成员之一，不仅在黑色素瘤表达，同时在其它多种肿瘤中均有不同程度的表达，能够诱导机体特异性的CTL反应，更重要的是在除和胎盘外的正常组织中均不表达，人们认为它是肿瘤特异性免疫治疗理想的靶分子之一［3-4］.重组人黑色素瘤抗原MAGE3/HSP70融合蛋白(专利申请号：ZL03134626.X)是我室研制和开发的一种新型肿瘤疫苗［5］，它对肝癌、胃癌、乳腺癌等常见恶性肿瘤具有良好的治疗效果和预防效果，在肿瘤的治疗方面具有潜在的临床应用价值［6］.本研究目的是实现重组人黑色素瘤抗原MAGE3/HSP70融合蛋白工程菌的高密度发酵，并用从发酵菌中纯化的目的蛋白，测定其在体内的抗肿瘤免疫效应，为通过动物肿瘤模型研究MAGE3/HSP70融合蛋白在肿瘤免疫治疗中的作用奠定基础.
1材料和方法
1.1材料含MAGE3/HSP70基因的重组表达质粒pET28a／MAGE3HSP70由本室构建，宿主菌BL21（DE3）本室保存.NBSBiofloⅣ20L自动发酵罐(NBS公司)；J6B型大容量冷冻离心机(Beckman公司)；微量蛋白电泳仪(BioRad公司)；KTAexplorer100层析系统(AmershamPharmaciaBiotech公司);实验动物是由第四军医大学实验动物中心引进繁殖的4～6wk龄二级C57BL/6小鼠40只，体质量18～20g，均为雌性，在SPF级饲养条件下进行试验.转MAGE3基因的小鼠黑色素瘤细胞B16MAGE3由本实验室马家海博士构建，MAGE3蛋白和HSP70蛋白由本实验室马家海博士提取并鉴定.小鼠IFNγELISPOT系统(法国Diaclone公司);Cytotox96检测试剂盒(Promega公司);Ficoll淋巴细胞分离液(Sigma公司);蛋白胨、酵母抽提物(Oxoid公司);SOURCE30Q及SephacrylS200HR(Pharmacia公司);IPTG(Sigma公司);抗MAGE3多克隆抗体(R&D公司);其余试剂均为国产分析纯试剂.
主要溶液的配制①种子液：1000mL种子液中含蛋白胨16g，酵母提取物10g，甘油20mL，NaCl5g，用5mol／LNaOH将pH值调至7.0；②发酵液：每升发酵液中含有蛋白胨20g，酵母抽提物9g，甘油5mL，十二水磷酸氢二钠6g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸铵1.5g，氯化铵1g，七水合硫酸镁0.25g，氯化钙0.02g，硫酸亚铁0.04g，甘氨酸0.5g.每升补料基质含有：甘油120mL，蛋白胨80g，酵母抽提物40g，七水合硫酸镁5g.
1.2方法
1.2.1种子培养取-70℃，100g/L甘油保存的pETHM/BL21(DE3)菌种1支，从中挑取1环，划含卡那霉素(Kan)的LB平板，37℃培养过夜，次日挑取一个边缘整齐、生长良好的单菌落接种到10mLLB培养基中(含35mg/LKan)，37℃振荡培养12h，以50g/L接种量转接1次，37℃继续培养4h左右，使其生长至对数生长期，以1%接种量转接至200mL种子液中，37℃振荡培养过夜.
1.2.2发酵采用20LNBSBiofloIV自控发酵罐，发酵总体积12L(0.6L种子液，0.74L发酵液，1.2L缓冲液，9.48LH2O)，含Kan(35mg／L).以AFSBioCommandBioprocessingSoftware(Version2.61)软件对其进行数据采集(每30s采集数据1次)，实现计算机在线控制，全过程共10h.控制参数为：①空气流量设定为12L/min，溶氧控制在40%，达到最大转速后，通入纯氧；②温度控制为37℃；③pH值设定为7.0，自动流加浓氨水以保持恒定；④搅拌速度：设定搅拌速度下限为200r/mim，上限为1200r/min.生长过程中当溶氧低于设定值时通过计算机由AFSBioCommandBioprocessingSoftware(Version2.61)软件控制每分钟增长5转.诱导过后，搅拌速度改为由NBSBiofloIV发酵罐自动溶氧反馈控制.⑤补料流加：在生长阶段，当溶氧率在3min内持续高于60％时补料泵以5％的速率进行补加营养.诱导阶段当溶氧值在3min内持续高于50％时补料泵以100％的速率进行补加营养1min.每1h取样测定A600nm值，当培养至A600nm=12时IPTG诱导目的蛋白表达，诱导4h后收集菌体，取小量进行SDSPAGE检测蛋白表达水平，其余菌体保存于-70℃用于纯化目的蛋白.
1.2.3目的蛋白的纯化4℃离心收菌，3mL/g菌体重悬于LysisBuffer（50mmol／LNaH2PO4，300mmol／LNaCl，10mmol／Limidazole，pH8.0)；加入溶菌酶至终浓度为10g/L，冰浴30min；超声裂解，功率2kW，超声10s，间隔10s，共30min；12000g，4℃离心15min，取上清，0.45μm针头滤器过滤；上NiNTASuperflow柱，WashBuffer(50mmol／LNaH2PO4，300mmol／LNaCl，20mmol／Limidazole，pH8.0)冲洗后ElutionBuffer(50mmol／LNaH2PO4，300mmol／LNaCl，250mmol／Limidazole，pH8.0)；洗脱，收集洗脱峰；SDSPAGE分析；以50倍体积的A液(20mmol／LTrisHCl，pH8.0)透析24h，中间换3次透析外液，透析后上清过用A液充分平衡的SOURCE30Q柱，用B液(20mmol／LTrisHCl，0.5mol／LNaCl，pH9.0)连续梯度洗脱4～5个柱床体积，收集洗脱峰，SDSPAGE分析；收集目的蛋白峰，以50倍体积的C液(20mmol／LTrisHCl，pH7.4)透析24h，中间换3次透析外液，透析后上清过用D液（137mmol／LNaCl，1.4mmol／LKH2PO4，1.7mmol／LKCl，4.3mmol／LNa2HPO412H2O，pH7.4）液充分平衡的SephacrylS200HR柱，收集洗脱峰；SDSPAGE及WesternBlot鉴定.Bradford法测定蛋白的含量，冻干，-70℃保存.
1.2.4动物免疫和小鼠脾淋巴细胞的分离与活化C57BL/6小鼠30只，随机分为5组，每组6只，各组分别于第1，10，20日腹腔注射蛋白免疫，MAGE3组注射MAGE3蛋白3.2μg（200pmol）；HSP70组注射HSP70蛋白15.8μg（200pmol）；MAGE3/HSP70组注射融合蛋白18.6μg（200pmol）；HSP70＋MAGE3组注射HSP70蛋白7.9μg（100pmol）和MAGE3蛋白1.6μg（100pmol），对照组注射PBS，100μL/(只次).末次免疫后10d，小鼠球后动脉取血，断颈处死，无菌取脾脏，毛玻璃片轻轻捻碎脾脏，10号针头轻轻吹吸数次，用Ficoll淋巴细胞分离液分离淋巴细胞.计数后，用AIMV培养液培养1d后用于后续试验.
1.2.5MAGE3特异性T细胞的检测采用IFNγELISPOT方法：依照法国DIACLONE公司ELISPOT检测试剂盒使用说明，用稀释好的捕获抗体（CaptureAntibody）100μL/孔包被PVDF板，4℃静置16h.20g/L脱脂乳PBS室温封闭2h，加入PBS，MAGE3，HSP70，MAGE3/HSP70和MAGE3＋HSP70免疫小鼠得到的脾细胞细胞1×104个/孔，同时加入转MAGE3基因的小鼠黑色素瘤细胞B16MAGE3细胞5×104个/孔，每个实验组设置3个复孔，50mL/LCO2纳胞培养箱静置培养20h.用PBS充分冲洗后加入检测抗体（DetectionAntibody），于37℃孵育2h，洗板，再加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，同上孵育洗板，加入底物显色液.避光显色20min，1200dpi扫描读取斑数，统计学分析.
1.2.6LDH释放法测定细胞杀伤效率方法参照文献［5］，主要步骤如下：以PBS，MAGE3，HSP70，MAGE3/HSP70和MAGE3＋HSP70免疫小鼠得到的脾细胞为效应细胞，以MAGE3基因的小鼠黑色素瘤细胞B16MAGE3细胞为靶细胞，以小鼠黑色素瘤细胞B16为对照，进行体外杀伤实验.靶细胞浓度为1×104个/孔，效靶比分别为5∶1，10∶1和50∶1，37℃共育4h，离心后，每孔吸取50μL上清液进行LDH检测.实验同时设立效应细胞自发释放孔，靶细胞自发释放孔，靶细胞最大释放孔和培养液背景孔.每个实验组设3个复孔，用AIMV无血清培养液洗涤重悬细胞，所有检测孔所测得吸光度值减去培养液背景即为实际值.按下公式计算：杀伤率=(实验组A-效应细胞自发A-靶细胞自发A)/(靶细胞最大A-靶细胞自发A)×100％.
统计学处理：统计资料均采用x±s表示，分析采用JMP统计软件（V5.0.1.2SASInstituteInc.）进行，组间比较采用方差分析处理，P
2结果
2.1工程菌的发酵为了获取足量的菌体进行研究，我们对工程菌进行了高密度发酵.用溶氧反馈、分批补料的方法，采用20LNBSBiofloIV发酵罐进行高密度发酵.接入种子液时菌体密度为A600nm=0.01，6h后达A600nm=12.8.200μmoL/LIPTG诱导表达目的蛋白，于诱导后4h终止发酵，发酵结束时A600nm=48.2，每升发酵液收湿菌70g，发酵曲线如图1.
图1pETMH/BL21(DE3)工程菌的发酵曲线（略）
2.2MAGE3/HSP70融合蛋白的表达及纯化结果显示，在诱导4h后，发酵菌体的重组蛋白表达量同摇瓶培养表达水平相当(图2A).发酵菌体裂解后取上清，经过NiNTASuperflow，SOURCE30Q及SephacrylS200HR纯化后，纯度可达90％以上(图2A).WesternBlot结果显示，纯化后的目的蛋白能够与抗人MAGE3多克隆抗体特异性结合(图2B).
AM:低分子质量蛋白标准;
1:未诱导pETMH/BL21(DE3);
2:摇瓶IPTG诱导pETMH/BL21(DE3);
3:发酵罐IPTG诱导pETMH/BL21(DE3);
4:纯化MAGE3/HSP70融合蛋白.B1:低分子质量蛋白标准;
2:未诱导pETMH/BL21(DE3);
3:纯化MAGE3/HSP70融合蛋白;
4:发酵罐IPTG诱导pETMH/BL21(DE3).
图2MAGE3/HSP70的原核表达与分离纯化（A）及WesternBlot（B）结果（略）
2.3体外肿瘤免疫学试验
2.3.1ELISPOT检测分泌IFNγ的MAGE3特异性T细胞数量与PBS组比较，HSP70组、MAGE3+HSP70组小鼠脾淋巴细胞中分泌IFNγ的T淋巴细胞频数没有明显变化，MAGE3组和MAGE3/HSP70组频数显著增加（P
2.3.2细胞毒性实验采用LDH释放实验，结果显示，效靶比为5∶1，10∶1和50∶1时，HSP70组及PBS组诱导的CTL对B16MAGE3细胞无特异性杀伤作用；MAGE3组、MAGE3+HSP70和MAGE3/HSP70组特异性杀伤作用显著增强，而且MAGE3/HSP70组特异性杀伤作用显著大于MAGE3组、MAGE3＋HSP70组（P
bP
图3ELISPOT检测蛋白疫苗免疫小鼠分泌IFNγ的T淋巴细胞频数（n=5，x±s）（略）
图4蛋白疫苗免疫的小鼠脾淋巴细胞对B16MAGE3细胞的特异性杀伤（n=5，x±s）（略）
3讨论
肿瘤免疫治疗在预防肿瘤复发、转移及治疗微小残留肿瘤病灶等方面有其独特的优势，是肿瘤综合治疗的重要组成部分.肿瘤免疫治疗的分子基础是肿瘤抗原可以激活机体特异性CTL杀伤肿瘤细胞.黑色素瘤抗原(MAGE)是一种肿瘤特异性抗原，是肿瘤特异性免疫治疗理想的靶分子［1-2］.其中MAGE3可以激活机体的细胞免疫系统，活化CTL特异性地识别并杀伤表达MAGE3的肿瘤细胞［3-4］.重组人黑色素瘤抗原MAGE3/HSP70融合蛋白是我室研制和开发的一种新型肿瘤疫苗［5］，实验表明，它对肝癌、胃癌、乳腺癌等常见恶性肿瘤具有良好的治疗效果和预防效果，在肿瘤的治疗方面具有潜在的临床应用价值［6］.作为广谱抗肿瘤药物的研究，其用量较大，为了得到大量的重组MAGE3/HSP70蛋白，就需要大量的诱导表达MAGE3/HSP70蛋白的基因重组菌体，而高密度发酵是获取大量基因重组菌体重要策略之一［7］.
为了进一步明确发酵表达并纯化的MAGE3/HSP70在体内的抗肿瘤免疫活性，我们利用检测细胞免疫反应的通用方法，酶联免疫斑点法(ELISPOT)和细胞毒性杀伤实验(LDH)检测了MAGE3/HSP70激活机体免疫反应的情况.结果发现用MAGE3/HSP70免疫小鼠，刺激机体产生分泌IFNγ的T淋巴细胞频数显著高于PBS组，HSP70组，MAGE3+HSP70组以及MAGE3组.同时LDH杀伤实验表明MAGE3/HSP70可以激活机体免疫系统产生特异性CTL杀伤表达MAGE3的肿瘤细胞，且显著高于其他各组，而对不表达特异性抗原的细胞没有杀伤作用.说明MAGE3/HSP70在制备过程中保持了药物的性能.本实验为MAGE3/HSP70的进一步应用奠定了基础.
【参考文献】
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对于一流高校理科专业的学生来说，在本专业继续深造是比较保险的出路，也是大多数人的选择，除此之外的举动，例如工作、转系等等，都被视为冒险项目。
与李杰的清闲相比，在上海，4岁孩子的父母们忙碌起来，5月和6月是幼儿园报名的高峰期，一些名牌幼儿园的名额早早就会被一抢而空，为了能在9月开学时给孩子寻找一条“金色起跑线”，家长必须提前数月打听情报、尽早在网上登记，“通路子”、找关系，有的家庭一家六口悉数出马，清早起床分赴不同幼儿园拿号排队，以便能让孩子在多家幼儿园得到“面试”机会。“和高考填志愿一样。”有家长在幼儿论坛的择园版抱怨，他们心力交瘁，同时也暗自担忧，如果从4岁起就如此疲于奔命。那未来的十几年学习生涯，甚至毕业后孩子的工作出路，都像是一副枷锁，牢牢束缚住他们的生活和希望。
“名牌大学”VS“理想的大学”
威尔肖茨是世界上唯一一个拥有“谜语学’学位的人，1974年，他进入印第安纳大学学习，该大学有一条规定――本科生可以自行设计学位课程，专业方向不限，只需要满足基础课及学分要求。这在很多高校是想都不敢想的规定，可是给了威尔一个机会，这个喜欢猜谜的年轻学生试着提交了一份谜语学学位课程计划。教授们虽然吃惊，最终还是批准了，于是他读完自己设计的谜语学课程，提交西方谜语史论文，随后考取弗吉尼亚大学法学院，三年后放弃考律师(美国律师的吃香程度相当于如今中国的公务员)，进了一家杂志社编写字谜。
如今，威尔的“成功业绩”包括《纽约时报》的纵横填空字谜和NPR周日字谜节目；家藏两万种古今谜语文献，包括十六世纪珍本；还创办了全美字谜大赛和万国谜语锦标赛，担任世界各地的谜语赛事的主席、评委或特邀顾问。
作家冯象在《理想的大学》一文中写道：“我在威尔身上看到了理想的大学，那里，学生可以自由发展个性与才智，而不必套进同样的模子，试图长成或装扮同样的人材。千人一面，一个脑袋。”
李杰谈论他们班那个“唯一去找工作的同学”时说：“他是一个比较有想法的人。已经直接保博了，可是想到未来5年都待在高校研究所里，而研究的项目又不一定是自己想做的，与其浪费青春，不如干脆进入社会锻炼。”
去年从北大生物系毕业的吴玫选择了一条截然不同的道路，她不尽然同意“保研―出国―直博”这一高校理科生的单一模式，毕业后当了一年古琴老师。“我的同学都觉得我很奇怪。”她穿着亚麻布的衣服，在琴馆过着弹琴、上课、喝茶这样相对悠闲的日子，她的父母也希望她能够继续深造，或者回西安去找一份稳定的工作，她现在需要给父母一个留在北京的理由，因此也考虑如何重新规划人生。跳出现有体制总要经历阵痛，吴玫不否认压力很大，虽然觉得在琴馆或许是一种逃避面对“模式化人生”的方式，可是她的眼神看上去颇为坚定，并不为自己的决定感到后悔。
“成人”VS“成功人士”
过了22岁这个坎，李杰和吴玫结束必要的学业，做出了自己对人生的选择，完成了没有仪式的成人礼，进入真正“成人’’阶段，“自己对自己的决定负责”，他们都提到了同样的一句话，然而却离目前社会价值观中“成人”的光环还很远。
李杰算了一笔账，如果去国外读博士，那么一年奖学金就有2万2千美元至2万5千美元不等，通常开销1万至1万5肯定够了，剩下的1万美元是“净赚”，5年下来也有5万美元的积蓄，按照现在的汇率计算，相当于30万人民币左右，“等拿到博士学位回来，买一套房子的首付算是有了。”
那些指望孩子将来上名牌大学，赚大钱的父母恐怕要失望了，“成人”与“成功人士”之间不划等号，22岁出国，读完博士已经29岁，该谈婚论嫁了，“没房没车谁要你々”李杰说。而如今家长的投入，光是属于非义务制教育的学前教育，费用已经不成比例的高。根据上海市的一项统计，幼儿园有“六大费用”是逃不了的：公办幼儿园伙食费4元／天；托管费在公办的示范幼儿园收费1200元左右／月，一般中等私立幼儿园的托班管理费是每月800多元，而收费高的则在1200元以上，有台、港地区投资背景的幼儿园一般是每月2000元，更有以美元收费的，折合人民币每月上万元；代办费用于幼儿园订阅幼儿教育类书籍、购买文具用品和卫生用品的支出，一般每学期收100至120元；中午睡觉要购买的被褥费80至400元左右，有些幼儿园还会要求购买校服，置装费大多在200元以上；休闲活动费，根据活动成本计算；特长兴趣班，这个收费过杂，无法计算。此外不包括赞助费。
问题在于，李杰的同学中，他很少听说有人上过课外补习班的，吴玫也如此。李杰的一个室友，初中二年级几乎没上过学，因为“他上初一时把初二和初三的教材都看了，说很简单嘛，没什么难的，他妈妈也管不了他，差点退学了。”事实上这名室友照样轻松考上了清华。巧立名目的补习班，顿时成了一种悖论。
“好好学习”VS“好好做人”
摘要：实践证明，只要学生有兴趣识字，并且掌握一定的识字方法，再通过少写多认多复现进行巩固，他们就可以轻松完成新《课标》提出的识字要求，为阅读奠定良好基础。本文结合自己的教学实际，介绍了一些识字教学的方法，仅供参考。
关键词：识字教学；拓宽渠道；激发兴趣
《语文课程标准》指出：“语文是一门实践性很强的课程，应着重培养学生的语文实践能力，而培养这种能力的主要途径也应是语文实践。”识字写字是第一学段语文教学的重点，而要提高识字教学的效率，关键的因素还是培养学生的自主识字能力，这种能力的培养不是一蹴而就的，需要老师花很大的功夫，想很多的办法。
一、幼儿园要努力为幼儿创设一个认读汉字的环境
首先，幼儿在一日活动中，同样也会碰到、看到各种东西。比如门窗、墙壁、桌椅、钢琴、玩具……凡是能用汉字标明的实物上都尽可能与汉字挂钩，让孩子们识物的同时就能见到与之对应的汉字。让幼儿在不知不觉中，自然而然地把图像、声音、语义、符号整合在一起，从而认识汉字。其次，教师在与幼儿交往中，也要注意营造一个认读汉字的环境。现在，不少幼儿园实行了在胸前佩带标志的制度。这不但能标明每个人的身份，而且具有教儿童识字的功能。我们只要把人名写入标志，在幼儿与教师和小朋友的交往中，他们就能认读其上面的汉字。最后，教师通过组织幼儿开展多种多样的活动，充分拓展他们识字的空间。也可以在区域活动中，向幼儿提供字典、图文并茂的图书，各类看图识字卡片等，供幼儿自己去查找感兴趣的文字。
二、拓宽识字渠道，鼓励学生生活识字
三、制作生字卡片是一种很好的学习识字的方式
学生自做的卡片虽然没有买来的好看规范，但正是这些各具特色的卡片才体现了学生的个性，培养了学生的创造能力。它至少可以起到这样一些作用：1、可以让学生在预习课文时提前与生字见面，在课后做卡片则可以起到巩固生字的作用，增加学生与生字见面的机会；2、在做卡片的过程中，可以抄写，可以剪贴，也可以配插图，勾花边，学生的动手操作能力得到了很好的培养；3、好动是孩子的天性，多样化的活动既符合孩子喜爱动手的特点，又避免了单纯抄写生字的枯燥和无聊，让学生真实地感受到学习生字是一项愉悦的活动，可以想象，这样的家庭作业是受孩子喜爱的。4、人手一套的生字卡片便于学生在小组学习中合作学习。孩子们拿着自己的小卡片，可以自己拼读，可以让同伴欣赏，也可以当小老师拿卡片来考考小组内的同学。可见，这小小的识字卡片真是为学生独立识字能力的培养插上了翅膀。
四、从课中遵循规律识字
五、引导学生发挥想象，激发识字兴趣
开始识字时，为了提高学生的学习兴趣，我告诉小朋友：我们中国的汉字很奇妙，一个汉字可以是一首诗、一幅画、一首儿歌、一个故事。小朋友听了便十分有兴趣。开始教生字时我有意识地把一些生字编成谜语，故事讲给他们听。小朋友听了之后很感兴趣，一下子就把生字记往了，之后，我便鼓励他们自己来给生字编编谜语，讲讲故事。小朋友的情绪很高涨，有的小朋友编得谜语相当出色，连老师都不曾想到，如“底”字，小朋友说：“有个小不点来到广场下买了一瓶乐百氏奶，‘底’字下面的一点代表小不点，不能漏掉。”但在教学时应适时点拨，引导，避免学生为了编个谜语，讲个故事就硬性把字拆开，强行把各部件编成没有任何联系的故事、谜语。
六、周期复现巩固识字
一、儿童节目定位的依据
电视节目的准确定位取决于节目的基本属性，儿童节目顾名思义是做给儿童看的节目。儿童节目定位的依据主要就是它的受众对象即观众，在电视事业日益发展的今天，儿童电视节目应该成为孩子们课余的伙伴，家庭的课堂，这一点已成为人们的共识。
二、儿童节目的定位与节目内容、形式的统一
对于儿童节目来说，定位容易，但具体操作起来却难，容易出现节目内容、形式与定位不相符的错位情况。儿童节目是做给孩子们看的，但做节目的却多是成年人，制作者往往带着成人的视角来想象儿童的喜怒哀乐和兴趣点，把成年人的主观思想强加给孩子。
为此，作为成年人的编导应该做到：
1.学会尊重。这里的尊重包括两方面内容：一是指要尊重儿童成长发展的客观规律。儿童的年龄特点决定了他们心理发展的特征，所以儿童电视节目制作者必须要根据儿童的心理特征和年龄特点来策划节目；二是指要尊重儿童本身。儿童有自己独特的情感世界，对外部世界有着独特的感知能力，观察问题、思考问题也有其独特的视角和方法，我们要平等地对待他们，把他们当做完整的、独立的一个人，深入地感受他们真实而丰富的心灵。
2.学会沟通。学会沟通，就是要以它们的视角观察世界，以它们的思维方式去思考问题。要走进他们的世界里，了解他们喜欢什么、讨厌什么、关心什么、害怕什么，这样他们才能接纳你，把你当成他们的朋友。在尊重儿童的基础上，与他们进行很好的沟通，孩子们就会很愿意把他们的心里话，把他们的喜好告诉我们，我们做出的节目也就能更加受到儿童的欢迎。